Wnt/β-catenin信号调控EMT水平对小鼠胚胎干细胞向肝脏组织结构分化的影响

目的 在前期体外诱导小鼠胚胎干细胞(ESC)向肝系细胞分化基础上,从细胞上皮间质转化(EMT)角度研究ESC分化为肝脏组织结构的可行性.方法 选用Balb/c小鼠ESC,首先利用肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等体外诱导ESC向肝系细胞方向分化,然后在分化中期(13 d)、成熟期(17 d)两个时间点动态抑制细胞Wnt/β-catenin信号以降低其EMT水平.最后在分化系统中观察分化细胞保持三维组织结构生长情况,检测其中肝系细胞和血管标志物白蛋白(ALB)、血管内皮生长因子(VEGFR)等表达情况,综合判断有无肝脏组织形成,并研究该过程中EMT水平变化的规律和机制.结果 ESC分化过程中,分化前期实验组EMT水平与对照组差别不明显,分化中、后期实验组EMT水平较对照组明显降低,分化第18天和20天,实验组上皮钙黏蛋白(E-cad)基因mRNA相对表达水平分别为0.61 ±0.15和0.47 ±0.05,对照组分别为0.07±0.05和0;实验组的ALB/AFP/CK8/CK19表达水平在同期内较对照组普遍偏高,标志物CD31/VEGFR1在分化中后期较对照组下降缓慢.在ESC培养上清液中,实验组ALB于第11天可检测到,浓度为(0.32±0.02) mg/L,而对照组ALB为(0.19 ±0.05) mg/L;实验组尿素于第13天开始检测到,浓度为(8.7±1.0)μmol/L,对照组尿素浓度为(3.1±1.2) μmol/L.ALB和尿素合成在ESC分化系统培养上清中浓度随分化时间延长而明显升高,并且实验组的ALB、尿素浓度值在相同的时间段内明显多于对照组.另外,实验组分化细胞可保持三维组织状态生长,对照组分化细胞最终呈单细胞状态.实验组可检测到肝系细胞标志物以及血管细胞标志物的表达,免疫荧光结果显示类肝细胞和血管结构紧密层状排列,HE染色提示有类肝小叶结构形成,而对照组无血管成分标志物表达.结论 ESC向肝系细胞分化中,在分化中、后期降低EMT水平,可有效促进ESC向肝脏组织结构分化.