细胞色素P450 2C9新突变1400T＞C的发现及体外酶活性研究

目的 明确1例华法林高敏感患者细胞色素P450 2C9酶（CYP2 C9）的新突变及其生物学功能.方法 提取患者基因组DNA,PCR产物利用直接测序法对CYP2C9、维生素K环氧化物还原酶复合物1（VKORC1）及细胞色素P450 4F2酶（CYP4F2）基因进行序列测定,与国际数据库比对分析确定是否存在碱基突变.通过定点诱变方法获得3种典型缺陷型CYP2C9＊2、＊ 3、＊13及新突变型CYP2C9的cDNA,利用Bac-to-Bac Baculovirus Expression System试剂盒,获得高表达各型CYP2C9变异体的昆虫微粒体.Western印迹法进行CYP2C9蛋白定量,以甲苯磺丁脲为探针底物药,体外测定不同药物浓度下各型CYP2C9变异体的最大反应速率（Vmax）和米氏常数（Km）,评价新突变类型对CYP2C9体外代谢活性的影响.结果 患者CYP2C9基因中发现全新的突变类型：1400T＞C,可导致CYP2C9第467位氨基酸发生变异（L467P）,VKORC1及CYP4F2基因无碱基突变.体外代谢实验结果显示,突变体CYP2C9＊2、＊3、＊13和L467P的体外酶学活性分别为野生型的91.58％、13.55％、0.11％和1.59％.结论 1400T＞C突变可大大降低CYP2C9的体外酶学活性,提示携带此突变型的患者在使用经CYP2C9代谢的药物时,药物代谢速度会明显减慢,容易造成体内药物蓄积,发生潜在的药物不良反应.