pcDPG基因治疗甲状旁腺功能减退症的实验研究

目的构建甲状旁腺激素（PTH）基因的重组真核表达质粒，评价体外转染后PTH基因的表达与生物学活性，同时观察其对甲状旁腺功能减退动物的基因治疗作用。方法（1）从人胚甲状旁腺组织中克隆PTH基因，拓扑法构建其重组真核表达质粒peDNA3．1-PTH-GFP（pcDPG），并采用酶切、聚合酶链反应（PCR）及DNA测序鉴定；（2）用脂质体转染peDPG人293细胞，观察绿色荧光蛋白（GFP）表达并计算转染率，同时逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）验证PTH基因的表达；（3）纯化转染细胞上清中PTH蛋白，进行生物学活性鉴定；（4）建立甲状旁腺功能减退症的家兔模型，将pcDPG质粒以肌肉注射进行分组治疗，监测血钙、磷和PTH值及存活时间，通过形态学观察各器官的病理变化。结果（1）酶切与PCR结果与预期相同，测序结果与文献中序列同源性为99．3％；（2）细胞转染后24h即可见GFP表达，随时间延长而表达增强，48h转染率达38．9％和62．5％，同时RT-PCR见PTH基因表达；（3）纯化的PTH蛋白可对抗甲状旁腺切除小鼠的抽搐症状；（4）模型兔术后第2d血钙（1．71mmol／L±0．09mmol／L，1．73mmol／L±0．03mmol／L，1．75mmol／L±0．03mmol／L，1．65mmol／L±0．04mmol／L）明显低于术前（2．82mmol／L±0．21mmol／L，P〈0．05），术后第2dPTH值（5．03pg／ml±0．05pg／ml，5．04pg／ml±0．05pg／ml，5．03pg／ml±0．07pg／ml，5．29pg／ml±0．03pg／ml）也明显低于术前（11．63pg／ml±1．60pg／ml），但是术后第2d血磷增高（P〈0．05），pcDPG质粒大、中剂量组治疗后48h血钙、磷与PTH值均恢复至正常。结论脂质体介导的质粒pcDPG体外转染率较高，能表达有活性的PTH蛋白，同时对甲状旁腺功能减退家兔有较好的疗效，从而为甲状旁腺功能减退症基因治疗的进一步研究奠定了基础。