葡萄糖糖基神经酰胺合成酶特异性小干扰RNA表达载体的构建及其逆转乳腺癌细胞耐药的研究

目的构建葡萄糖糖基神经酰胺合成酶(GCS)小干扰RNA表达载体，观察其对乳腺癌耐药细胞(MCF-7／ADR)GCS基因表达和耐药性的影响。方法设计合成2对GCS基因的特异性siRNA，分别定向克隆入真核表达载体pSUPER，构建pSUPER-GCS1和pSUPER-GCS2重组质粒，脂质体Lipofect AMINE2000介导转染MCF-7／ADR细胞，空载体pSUPER转染作为对照，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析GCS mRNA的表达，流式细胞仪观察GCS蛋白的表达，四氮唑盐法检测阿霉素对MCF-7／ADR细胞的半数抑制浓度(IC50)，流式细胞技术检测细胞凋亡率的改变。结果酶切分析和测序证实成功构建了针对GCS的siRNA表达载体pSUPER-GCS1和pSUPER-GCS2。两对重组质粒均可特异性抑制GCS基因表达，转染后48h GCS mRNA抑制率分别为89．4％、88．5％，GCS蛋白含量分别下降为8．3％±1．0％，9．2％±0．8％，四氮唑盐法显示重组质粒对阿霉素耐药性相对逆转率分别为93．7％、91．6％，明显提高了乳腺癌细胞对于阿霉素的药物敏感性，流式细胞仪结果表明细胞凋亡率增加为15．38±1．16，13．92±1．73，而空载体对照组无以上作用。结论GCS特异性siRNA表达载体构建成功，且有效抑制了GCS基因表达，并通过诱导耐药细胞凋亡率增加，逆转乳腺癌细胞多药耐药。