新型Tet—On反式激活因子对GDNF基因腺相关病毒载体表达调控的研究

目的通过在胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因腺相关病毒(AAV)表达载体中插入改良的Tet—On调控因子，达到有目的调节GDNF的表达，避免基因过度表达或重组可能对宿主产生的危害。方法首先在pAAV—GDNFflag前病毒质粒的hHG部分插入寡核苷酸序列，通过含相应酶切位点的引物，聚合酶链反应(PCR)扩增反式激活因子rtTA2s—S2和四环素反应元件(TIRE)，并插入寡核苷酸序列，构建pAAV—rtTA2s—S2-TRE-GDNFflag。与辅助质粒共转染HEK293细胞完成重组腺相关病毒(rAAV)载体的包装，氯化铯梯度超速离心分离病毒裂解液，半透膜提纯病毒载体，实时定量PCR(RQ—PCR)检测病毒效价。rAAV感染HEK293细胞，荧光显色和Western印迹法检测rtTA2s—S2的体外调控；rAAV感染Wistar小鼠腓肠肌，酶联免疫吸附实验(ELISA)检测GDNF基因表达的体内调控。结果体外实验强力霉素阳性组Western印迹可见明显GDNF条带，阴性组未见；体内实验强力霉素阳性组GDNF在2周内表达(32．6ps／ml±2．6ps／m1)，高于强力霉素阴性组(10．1pg／ml±2．4pg／m1)，差异有统计学意义。结论Tet—On反式激活因子rtTA2s—S2、TRE和GDNF基因可构建在同一AAV载体，通过调节诱导剂强力霉素的浓度，rtTA2s—S2在体内和体外均能有效调控下游目的基因GDNF的表达。