shRNA介导的RNA干扰对小鼠T淋巴细胞CD28基因的沉默效应

目的 探讨短发夹状RNA（shRNA）对C57BL／6J小鼠T淋巴细胞CD28共刺激分子基因沉默效应，评价shRNA对目的基因干扰效应的时效性和稳定性，筛选出高效的干扰序列用于后期的动物实验。方法 首先构建3个载有CD28特异性shRNA（shRNA1～3）的表达质粒和1个非特异性shRNA表达质粒，将其分别转染小鼠脾淋巴细胞，以非特异性的shRNA表达质粒组和未转染组分别作为阴性对照和空白对照，采用实时荧光定量PCR和Western blot方法分别从基因和蛋白质水平评价转染1—20d内CD28shRNA对CD28基因的干扰效应，并筛选出干扰效率最高的序列。结果 ①成功构建了CD28shRNA表达载体；②3种CD28shRNA均可在mRNA和蛋白质水平有效沉默目的基因。与实验对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）：CD28mRNA拷贝数持续降低，3种CD28shRNA转染C57BL／6J小鼠脾细胞20d，小鼠脾细胞CD28mRNA拷贝绝对数分别下降了99．62％、99．89％和99．80％；CD28蛋白表达水平分别降低了（84．90±0．65）％、（96．49±0．03）％和（91．76±0．32）％，以CD28shRNA2组的抑制效率最高（P〈0．01）。结论 ①特异性的CD28shRNA可长期、稳定地介导CD28基因沉默；②针对CD28基因不同位点的不同shRNA也有干扰效率的差异。