脐血巨核细胞体外扩增及其功能的研究

目的研究扩增后脐血巨核细胞的生物学特性和功能，为脐血巨核细胞的扩增和临床应用提供依据。方法收集足月妊娠健康新生儿的脐带血，免疫磁珠法分离出其中的CD34^＋细胞。采用血小板生长因子（thrombopoietin，TPO）＋干细胞因子（stem cell factor，SCF）＋白细胞介素3（interleukin-3，IL-3）＋IL-6和TPO＋SCF两种细胞因子组合，将富集的脐血CD34^＋接种于无血清无基质细胞的悬浮培养体系中，分别在3、7、10、14d收集扩增产物。运用流式细胞术检测巨核细胞的表型；血浆块法检测巨核细胞集落（colony forming unit-megakaryocyte，CFU-MK）的形成；对巨核细胞进行DNA含量检测以评价其成熟程度；血小板体外活化实验及SCID小鼠体内移植实验评价扩增后巨核细胞的功能。结果不同细胞因子组合和培养时间扩增后，巨核细胞的数量和生物学特性不同。随着培养时间的延长，巨核细胞（CD41^＋）的数量逐渐增加，但培养至14d时增势减缓。因子组合TPO＋SCF＋IL-3＋IL-6各时间段的扩增能力（分别扩增5．2、40．7、121．2、149．7倍）均比因子组合TPO＋SCF（分别扩增3．8、27．4、85．9、106．5倍）强，但因子组合TPO＋SCF的扩增能力仍能满足临床的需要。巨核祖细胞（CD34^＋CD41^＋）的数量在第7天时最多（分别增加43．4和36．2倍），这也被CFU-Mk所证实。DNA含量检测发现，随着培养天数的增加，多倍体细胞所占的百分比增加。体外血小板活化实验证实，扩增的巨核细胞在体外可产生血小板，有正常巨核细胞功能。移植后两组小鼠的骨髓中均检测到人CD45^＋和CD41^＋细胞。小鼠外周血中人血小板在移植后3d就可测到，5d就可达到高水平（分别为20．7％和17．9％），维持20d以后才逐渐下降。结论通过对扩增后巨核细胞的生物学特性的研究，有助于寻找有效、简便、易于植入受者体内的扩增方法。体外扩增的脐血巨核细胞可植入骨髓并产生功能正常的血小板。