欧亚类禽H1N1猪流感病毒抗原性变异关键氨基酸的鉴定与分析

[背景]流感病毒的抗原性主要是由病毒的表面糖蛋白HA决定的,前期利用欧亚类禽型H1N1猪流感病毒(EA H1N1 SIV)HA蛋白单克隆抗体(mAb)筛选抗原逃逸株发现,HA蛋白 190、230和269位(H3编码)氨基酸的改变能够导致病毒发生抗原逃逸,并发现在新近分离的EA H1N1 SIV HA蛋白广泛存在这3个氨基酸的变异.[目的]进一步探索哪些氨基酸对病毒的抗原性具有关键作用,为流感的防控提供科学依据.[方法]选取一株病毒A/swine/Liaoning/SY72/2018(H1N1)SY72 为模式病毒,建立该病毒的反向遗传系统(RGS),又以SY72 为骨架,拯救含有HA基因 190、230 和 269 单点突变重组病毒;利用rSY72病毒制备灭活疫苗,分别免疫SPF鸡和非免疫猪制备其相应的血清,通过中和试验和血凝抑制(HI)试验分析病毒的抗原性,确定影响病毒抗原性的关键氨基酸位点;继而评估HA蛋白不同位点氨基酸的改变对病毒复制特性及受体结合特性等的影响.[结果]分析SY72病毒的HA氨基酸序列发现,该病毒HA蛋白分别含有190D、230M和269R.利用反向遗传技术,分别拯救了病毒rSY72 及单点突变病毒rSY72HA/D190N、rSY72HA/M230I和rSY72HA/R269M;中和试验结果表明,与rSY72相比较,3株突变病毒均能够与两株mAbs发生一定反应;HI试验结果显示,与rSY72 相比较,突变病毒rSY72HA/D190N与 rSY72 免疫鸡血清和猪血清的反应减弱,HI 抗体效价分别出现了 4 倍和 8 倍的差异,而病毒 rSY72HA/M230I 和rSY72HA/R269M与两种血清的反应差异不明显,表明HA蛋白 190 位氨基酸改变对病毒的抗原性影响最为明显;病毒蚀斑测定及复制动力学研究结果发现D190N 的氨基酸替换导致病毒rSY72HA/D190N在MDCK细胞上形成的蚀斑减小,而R269M的氨基酸替换导致病毒rSY72HA/R269M在MDCK细胞上的复制能力下降;3个位点的氨基酸替换均未影响病毒的受体结合特性.[结论]HA蛋白190位氨基酸对EA H1N1 SIV抗原性具有决定作用,269位氨基酸突变使得病毒在MDCK细胞上的复制能力降低.这提示在后续开展的病原学监测中要密切关注这些氨基酸的变异情况,提高对动物流感的预警预报.