VvmiR164s-VvNAC100作用模块鉴定及其在葡萄子房发育过程中响应赤霉素的表达分析

[目的]鉴定葡萄miR164s(VvmiR164a/b/c/d)及其靶基因,明确VvmiR164s及其靶基因应答外源赤霉素在葡萄单性结实过程中的调控作用.[方法]以'魏可'葡萄(Vitis vinifera L.Wink)为试材,利用miR-RACE、PCR、RLM-RACE与PPM-RACE、qRT-PCR及生物信息学等技术,分析VvmiR164s-VvNAC100模块应答外源赤霉素在葡萄单性结实过程中的时空表达特征及其潜在功能.[结果]赤霉素在花前处理'魏可'葡萄,可诱导其单性结实,导致葡萄的无核.克隆鉴定了VvmiR164a/b/c/d的精确序列,预测到其4 条靶基因VvNAC100-1、VvNAC100-2、VvNAC098、VvNAC021,结合匹配程度与前期数据,在此重点分析靶基因VvNAC100-2,并将其命名为VvNAC100.克隆鉴定靶基因VvNAC100,验证其裂解位点,并对其开展蛋白进化、染色体定位及结构分析.VvNAC100裂解位点位于miRNA 5′端的第9位与第11位,裂解频度为17/20与11/20,定位于葡萄的Chr14 上,编码 363 个氨基酸,含有一个NAM结构域,且其定位于细胞核.VvNAC100 蛋白与其他物种氨基酸序列保守性较高,功能相似,其中与辣椒、烟草等物种亲缘关系较近.VvMIR164a/b/c/d的启动子与其靶基因VvNAC100的启动子均包含多种激素作用元件,表明其可能通过响应不同的激素来参与葡萄生长发育的调控.RT-qPCR结果显示,随着葡萄子房的发育,VvmiR164b的表达水平呈下降趋势,其靶基因VvNAC100在子房发育前期呈上升的表达趋势,具有一定的负相关,而VvmiR164a/c/d与VvNAC100表达模式相似,呈现一定的正相关;GA处理后,VvmiR164a/c/d在葡萄子房单性结实过程中的表达极显著地上升,进而也显著抑制了VvNAC100在这一时期的表达,从而促进了VvmiR164a/c/d-VvNAC100表达水平的负相关;但VvmiR164b在GA处理后表现出下降的趋势,且其与VvNAC100的表达水平呈现一定的正相关,表明GA处理增强了VvmiR164a/c/d对VvNAC100的负调控,减弱了VvmiR164b对VvNAC100的负调控作用.[结论]VvNAC100是VvmiR164家族VvmiR164a/b/c/d的真实靶基因;在葡