响应槲皮素诱导的美国白蛾P450基因及CYP6ZB2功能分析

[目的]明确美国白蛾(Hyphantria cunea)响应槲皮素诱导的差异表达P450基因及系统发育关系,探究美国白蛾P450基因对槲皮素诱导的剂量效应,以及P450基因在美国白蛾对槲皮素的解毒适应中的作用.[方法]基于槲皮素诱导的美国白蛾中肠转录组数据,从中筛选显著差异表达的P450基因,应用MEGAX软件对5个P450基因及其他近缘物种的P450基因进行系统进化关系分析;通过RT-qPCR技术检测5个P450基因在不同槲皮素浓度(0.5％、1.0％、2.0％和4.0％)处理下的表达模式;克隆CYP6ZB2全长cDNA序列,利用RNA干扰(RNAi)技术探明CYP6ZB2基因沉默对美国白蛾体重及存活率的影响.[结果]从转录组的差异表达基因中筛选到5个显著响应槲皮素诱导的P450基因,经P450命名委员会分别被命名为CYP4G296、CYP4G297、CYP333A30、CYP304F33 和 CYP6ZB2(GenBank 登录号:ON032363-ON032367).系统发育分析表明,这5个基因被聚类到CYP2、CYP3、CYP4和线粒体CYP进化枝.RT-qPCR结果表明,P450基因响应槲皮素胁迫具有显著的剂量效应,CYP4G297、CYP304F33、CYP333A30和CYP46296的表达均被不同浓度槲皮素抑制,CYP6ZB2的表达在0.5％-2.0％的槲皮素诱导下显著上调,而在4.0％的槲皮素浓度下被显著抑制.克隆CYP6ZB2的全长cDNA序列,CYP6ZB2具有完整的开放阅读框(ORF),编码500个氨基酸.RNAi结果表明,注射两种剂量(500和1 000 ng)dsCYP6ZB2均可显著抑制CYP6ZB2的表达,注射1 000 ng dsCYP6ZB248 h后干扰效率达到最高(96.9％).CYP6ZB2被干扰的美国白蛾幼虫经0.5％槲皮素处理后体重增长量低于对照组,存活率(53.33％)分别为未处理组的61.5％和注射双蒸水组的72.7％(P＜0.05).[结论]筛选鉴定到美国白蛾响应槲皮素诱导的5个P450基因,槲皮素对5个基因的诱导表达具有明显的剂量效应,说明不同的P450基因对槲皮素的响应模式存在差异.RNAi能高效沉默CYP6ZB2,0.5％槲皮素对CYP6ZB2被干扰的美国白蛾幼虫的生长发育具有一定抑制作用,表明CYP6ZB2在美国白蛾对槲皮素的解毒适应中发挥着重要作用.