miR-221靶向IRS1抑制绵羊乳腺上皮细胞活力和增殖

[背景]MicroRNAs(miRNA)是一类小RNA分子(18-23nt),广泛参与了家畜乳腺发育和泌乳性能的调控.项目组前期在小尾寒羊上应用RNA-Seq研究发现,miR-221在空怀期乳腺组织中的表达量是泌乳期的3.6倍,但是尚不清楚miR-221对绵羊乳腺发育的调控机制.[目的]探讨miR-221是否通过靶向基因IRS1抑制绵羊乳腺上皮细胞的活力和增殖数量,为揭示miR-221对绵羊泌乳性能的分子调控机理提供理论参考.[方法]采集小尾寒羊乳腺、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏、背最长肌和卵巢等8个组织样本,采用实时荧光定量PCR(reverse transcription-quantitative PCR,RT-qPCR)技术,构建miR-221在绵羊8个组织中的表达谱.采用细胞转染、CCK-8和Edu等方法,研究miR-221对绵羊乳腺上皮细胞活力和增殖的影响.利用miRDB和miRanda数据库,预测miR-221的靶基因,结合功能富集分析,确定目标靶基因,构建靶基因的野生型和突变型载体,进而用双荧光素酶报告实验,验证miR-221与预测靶基因间的靶向关系.分析过表达和沉默miR-221对靶基因及其信号通路下游功能基因的影响.[结果]RT-qPCR结果表明,miR-221在绵羊乳腺等8个组织中均表达,其中在肺脏和脾脏中的表达量最高,在背最长肌和肾脏中的表达量最低.CCK-8结果表明,miR-221模拟物抑制了绵羊乳腺上皮细胞的活力(P＜0.01),而miR-221抑制剂提高了乳腺上皮细胞的活力(P＜0.05).Edu试验发现,miR-221模拟物减少了 Edu标记的阳性乳腺上皮细胞数量(P＜0.01),而miR-221抑制剂增加了 Edu标记的阳性乳腺上皮细胞数量(P＜0.01).双荧光素酶报告实验结果表明,miR-221模拟物抑制了胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1,IRS1)基因3'UTR区域的双荧光素酶活性(P＜0.01),而miR-221抑制剂提高了该基因的活性(P＜0.05),表明IRS1是miR-221的一个靶基因.RT-qPCR结果进一步发现,过表达miR-221降低了绵羊乳腺上皮细胞中IRS1和PIK3R1的表达量(P＜0.05),沉默miR-221则提高了这2个基因的表达量(P＜0.05).过表达或沉默miR-221对乳腺上皮细胞中IGF1R的表达