硒对S.aureus诱导的奶牛乳腺上皮细胞Nod2/MAPK/mTORs信号通路关键蛋白表达的影响

[目的]硒(Se)能否通过Nod2/MAPK/mTOR途径调控金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤,有待于进一步研究.因此本研究将探究硒对金黄色葡萄球菌(S.aureus)感染的奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)Nod2/MAPK/mTORs信号通路中关键蛋白表达的影响,从而为阐明硒的免疫调控机制提供理论依据.[方法]首先将bMECs以1 06细胞/孔接种于6孔板中,当细胞超过80％的汇合度时,用含2、4和8μmo 1·L-1浓度硒的培养基替换原来的培养基,继续孵育12h,然后用PBS洗涤每孔3次,将S.aureus按MOI=1∶1的比例加入6孔板中,继续培养0.5h,然后收集bMECs细胞进行相关蛋白的检测.本试验共分3大组,即对照(Con)组(bMECs)、模型(Mod)组(bMECs+S.aureus)和试验组.其中试验组又分3个亚剂量组,即Low组(bMECs+2 μmol·L-1 Se+S.aureus)、Mid组(bMECs+4 μmol·L-1 Se+S.aureus)和Hig组(bMECs+8 μmol·L-1 Se+S.aureus),每组设3个重复.利用BCA蛋白测定试剂盒对收集的bMECs细胞进行总蛋白提取.应用Western blotting技术检测bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK,AKT和mTOR蛋白磷酸化水平.将蛋白样品加到10％的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中,上样量为20 μg/孔,之后将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上.将PVDF膜用5 mL 5％脱脂乳阻断2h,脱脂乳脱脂后用TBST清洗后,分别用5 mL的Nod2、RIP2、JNK、AKT、mTOR和p-actin的一抗孵育过夜,回收一抗.之后在PVDF膜中分别加入5 mL上述蛋白的二抗,室温孵育2h,回收二抗.PVDF用TBST洗涤5次,最后在暗室条件下进行化学显影.[结果]S.aureus能显著提高bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK,AKT和mTOR蛋白磷酸化水平(P＜ 0.01).S.aureus感染0.5h后,Nod2蛋白水平显著升高(P＜0.01).在培养基里添加2μmol·L-1的硒可极显著抑制Nod2蛋白的表达(P＜0.01),在培养基里添加8 μmol·L-1的硒可显著抑制Nod2的表达(P＜0.05);S.aureus感染0.5h后,RIP2蛋白水平显著升高(P＜0.05