绿色荧光蛋白基因原核表达质粒 ｐＥＴ３２ａＡｃＧＦＰ１的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

为了构建绿色荧光蛋白 ＡｃＧＦＰ１基因的原核表达载体 ｐＥＴ３２ａ-ＡｃＧＦＰ１，并诱导使其在大肠杆菌中高效表达，本研究以 ｐＩＲＥＳ-ＡｃＧＦＰ１质粒为模板，采用 ＰＣＲ技术特异性扩增绿色荧光蛋白 ＡｃＧＦＰ１基因，通过酶切和连接使其与原核表达载体 ｐＥＴ３２ａ（＋）构成重组子，经 ＰＣＲ、酶切和测序鉴定后，重组质粒转化大肠杆菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３），用不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷 （ＩＰＴＧ）诱导表达绿色荧光蛋白，经 １５％ ＳＤＳ-ＰＡＧＥ鉴定，结果显示：重组质粒 ｐＥＴ３２ａ-ＡｃＧＦＰ１中的 ＡｃＧＦＰ１序列与 Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司的 ｐＩＲＥＳ-ＡｃＧＦＰ１质粒的 ＡｃＧＦＰ１序列完全一致，表明本实验已成功构建了含有绿色荧光蛋白基因 ＡｃＧＦＰ１的原核表达质粒。此外，ｐＥＴ３２ａ-ＡｃＧＦＰ１转化 Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３），经不同浓度的 ＩＰＴＧ诱导，ＳＤＳ-ＰＡＧＥ检测均获得高效表达，为今后构建 ｐＥＴ３２ａ（＋）-ＴＡＴ-ＡｃＧＦＰ１融合表达载体以及深入研究 ＴＡＴ的细胞膜穿透作用的机制奠定基础。