美洲商陆PaENO基因克隆及其表达分析

Q785%Q786; 烯醇化酶(enolase,ENO)作为糖酵解途径的一个酶,还能够参与植物生长发育以及应对非生物胁迫.该研究以镉超富集植物——美洲商陆(Phytolacca americana L.)为材料,根据美洲商陆转录组数据,设计特异性引物,从叶片中克隆PaENO基因,并进行序列分析、原核表达与纯化、表达模式分析以及抗镉实验,为深入研究PaENO蛋白的酶活性质以及PaENO基因在美洲商陆应对镉胁迫过程的功能机制奠定基础.结果表明:(1)成功克隆获得PaENO基因(GenBank登录号为JN656932.1),该基因开放阅读框为1335 bp,编码444个氨基酸.(2)多序列比对分析显示,PaENO蛋白与冰叶日中花的ENO蛋白序列一致性最高,为93.47％;系统进化分析表明,PaENO与冰叶日中花、甜菜、菠菜的亲缘关系较近,处于同一进化分支.(3)RT-PCR结果显示,PaENO基因在美洲商陆叶中表达量最高为根的2.5倍,茎中表达量最低,仅为根的1/5;Cd胁迫后PaENO基因表达水平显著升高,并于2 h时PaENO基因表达量迅速升高至Cd胁迫前(0 h时)的9.54倍,Cd胁迫12 h、24 h时降低到0 h时的3.12倍和2.89倍,说明PaENO基因参与了美洲商陆应对Cd胁迫的响应.(4)通过成功构建原核表达载体pET28a-PaENO并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,在50 kD左右出现目的条带,然后用超声破碎大肠杆菌细胞,离心后分别取上清和沉淀,SDS-PAGE检测发现,PaENO在上清和沉淀中都有表达,而且在上清中的表达量较高;使用Ni亲和层析试剂盒纯化PaENO蛋白,获得了纯化的PaENO蛋白;镉抗性实验结果初步证实,表达PaENO蛋白能够显著提高大肠杆菌对镉的抗性.研究认为,PaENO蛋白可能以转录因子(PaMBP-1)的形式在美洲商陆应对镉胁迫过程中发挥调控作用.