利用CRISPR/Cas9技术构建脂多糖结合蛋白基因敲除小鼠

R-332%Q95-33; 目的 利用成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白核酸酶9(CRISPR-associated nuclease 9,Cas9)基因编辑技术构建稳定遗传的脂多糖结合蛋白(lipopolysaccaride binding protein,Lbp)基因敲除小鼠.方法 根据C57BL/6J小鼠的Lbp基因序列特征,设计sgRNA靶点,删除Lbp基因5'-端蛋白编码保守序列并引入移码突变,使编码LBP失活.提取F0、F1、F2、F3代小鼠基因组,PCR鉴定并测序验证Lbp基因敲除效果,RT-PCR测序验证Lbp基因转录水平,蛋白质印迹法验证F2代LBP蛋白表达水平.结果 F0代获得5只杂合子敲除小鼠(Lbp+/-)、F1代获得3只Lbp+/-小鼠,F2代获得4只Lbp纯合子敲除小鼠(Lbp-/-),F3代获得30只Lbp-/-小鼠.RT-PCR测序表明,Lbp-/-小鼠mRNA缺失244 bp且发生移码突变,导致翻译提前终止.蛋白质印迹证明Lbp-/-小鼠肝脏组织中无LBP蛋白表达.结论 通过CRISPR/Cas9技术成功构建可以稳定遗传的Lbp基因敲除小鼠,为后续进一步研究LBP的免疫及其生理作用提供基础.