杜仲半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因EuCPI的克隆及功能分析

S718.46; [目的]以杜仲种仁为试材,克隆EuCPI基因全长序列并分析其结构特征,探究该基因的抗逆功能及对黄粉虫生长发育的影响,为今后深入研究其抗逆机制提供理论基础.[方法]提取杜仲种仁的RNA并反转录成cDNA,采用RACE技术扩增EuCPI基因的全长cDNA序列;利用生物信息学网站对其所编码蛋白的理化性质及结构功能进行分析预测;利用pET28a质粒构建原核表达重组载体,对重组蛋白进行SDS-PAGE、Western Blot及蛋白纯化试验;利用重组的原核表达系统探究在盐胁迫和高温胁迫下含有EuCPI基因的大肠杆菌和对照组之间生长曲线的不同,初步鉴定该基因对大肠杆菌的影响;此外,利用诱导后的重组菌液饲喂黄粉虫,探究EuCPI基因对黄粉虫生长发育的影响.[结果]EuCPI基因具有547 bp的全长序列(GenBank登录号:MT702592),开放阅读框(ORF)为309 bp,编码蛋白由102个氨基酸组成,理论等电点(pI)为6.41,分子质量为11.17 kDa,不稳定指数为27.73,属于稳定蛋白,总平均亲水性为-0.416,属于亲水蛋白.氨基酸序列分析结果表明,EuCPI蛋白无跨膜结构,无信号肽,主要由50％的 α-螺旋、36.27％的无规则卷曲、11.76％的延伸链和1.96％的 β-折叠组成,属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族.系统进化树分析结果表明,该蛋白与欧洲栓皮栎CPI编码蛋白同源性较高.通过构建的原核表达载体pET28a-EuCPI,诱导表达并纯化出15.29 kDa大小的重组蛋白.高温胁迫试验生长曲线结果表明,在37℃条件下前10 h含有EuCPI基因的BL21(DE3)大肠杆菌与对照组长势基本一致,而在42℃和50℃条件下前10 h含有EuCPI基因的菌生长速度明显大于对照组,且对照组出现明显的生长抑制情况.固体培养基盐胁迫试验结果表明,随着培养基中NaCl浓度增加,试验组和对照组菌落均出现生长抑制现象,但含有EuCPI基因的菌落数量明显多于对照组,尤其在0.75 mol·L-1时,前者有较多的单菌落存活而后者无单菌落存活;液体培养基盐胁迫试验生长曲线结果表明,在0.25 mol·L-1 NaCl浓度条件下,前8 h含有EuCPI基因的BL21(DE3)大肠杆菌生长速度明显大于对照组,且对照组出现明显的生长抑制现象.饲虫试验结果表明,取食含有EuCPI基因的饲料的黄粉虫体质量呈下降趋势,而