杉木叶片原生质体分离及RNA提取体系的建立

S718.46; [目的]以杉木组培苗幼嫩叶片为材料,分析不同因素对杉木原生质体分离的影响,建立杉木叶片原生质体分离体系,以期为杉木基因功能验证提供有效的技术平台;比较不同RNA提取方法,筛选获得杉木原生质体总RNA提取的有效方法,为今后利用杉木原生质体开展分子生物学研究提供技术支持,也可为其他林木原生质体的总RNA提取研究提供参考.[方法]选取杉木组培苗最上端未分轮的幼嫩叶片为材料,通过分析5种不同酶组合、真空处理时间(0、5、10、15、20 min)、渗透压(0.3、0.4、0.5、0.6 mol· L-1甘露醇)、BSA浓度(0.1％、0.2％、0.3％、0.4％)及酶解时间(1、2、3、4、5 h)5个条件,进行杉木叶片原生质体的分离.采用改良Trizol法、改良Trizol+ 10 μg糖原法、CTAB-LiCl法、CTAB-LiCl+ 10 μg糖原法、改良CTAB-异丙醇法、改良CTAB-异丙醇+10 μg糖原法、天根RNA提取试剂盒法共7种方法提取杉木原生质体RNA,通过杉木内参基因和2个特异基因进行RNA质量验证,比较不同方法的提取效果.[结果]在1.5％纤维素酶R-10、1％离析酶R-10、0.2％果胶酶Y-23、0.5 mol·L-1甘露醇以及0.3％ BSA的混合酶液中,真空处理10 min,酶解2h,可分离出高活力的纯净杉木原生质体,其产量可达到7.27×106个·g-1,活力可达到94％.7种方法皆能提取出杉木叶片原生质体的总RNA,但不同方法间存在明显差异,其中改良Trizol法、改良Trizol+ 10 μg糖原法、改良CTAB-LiCl法、改良CTAB-LiCl+ 10 μg糖原法提取的RNA有不同程度的降解现象,其余方法所提取的RNA完整性较好,且OD260/280和OD260/230值均在1.8～2.0范围内;在RNA得率方面,改良CTAB-异丙醇+10 μg糖原法可高效提取杉木原生质体RNA,106个细胞RNA产量平均可达到6.89μg,分别是改良CTAB-异丙醇法和天根RNA提取试剂盒法的1.73倍和1.58倍;综合考虑,改良CTAB-异丙醇+ 10 μg糖原法提取杉木原生质体RNA的效果最好.[结论]以杉木组培苗幼嫩叶片为材料,分离条件为纤维素酶R-10浓度1.5％、离析酶R-10浓度1％、果胶酶Y-23浓度0.2％、甘露醇浓度0.5 mol·L-1、BSA浓度0.3