桑树Na＋/H＋逆向转运蛋白基因（MnNHX1）的克隆与耐盐力表达

【目的】研究川桑液泡膜型 Na ＋/H ＋逆向转运蛋白（ NHX）基因的功能，探究桑树耐盐机制，为植物抗逆基因工程筛选提供优良的候选基因。【方法】以川桑基因组数据库为基础，基于同源基因序列的保守性，以川桑叶片 cDNA为模板克隆川桑液泡膜型 NHX基因；利用生物学软件和在线公共平台，分析所得基因编码的蛋白质序列及功能结构域，并构建系统进化树，分析与其他物种的亲缘关系。采用荧光定量 PCR方法研究在 NaCl胁迫条件下不同时间段‘湖桑32号’根、茎、叶等不同组织中桑树 NHX1表达量的变化情况；通过构建超量表达载体，将其转化到拟南芥中，分析转基因拟南芥在 NaCl胁迫环境中的种子发芽数，根长、侧根生长情况和幼苗成活率，并对转基因拟南芥连续浇灌含高浓度 NaCl的营养液，研究过量表达 NHX 基因对拟南芥的影响。【结果】本研究得到1个液泡膜型 NHX 基因，命名为 MnNHX1（ GenBank 登录号： KJ720637）；该基因 ORF 长度为1644 bp，编码547个氨基酸残基，具有 Na ＋/H ＋交换泵，且在其上游含有抑制剂氨氯吡嗪脒结合位点（ LFFIYLLPPI）以及糖基化位点等结构域，TMHMM 在线程序预测 MnNHX1具有12个明显的跨膜结构区；系统进化树分析结果显示，MnNHX1具有较高的保守性，先与源于蔷薇科的桃聚合，与桑树形态学和基因组进化分析分类结果一致。荧光定量 PCR 试验表明，在无 NaCl 胁迫条件下桑树 NHX1在‘湖桑32号’根、茎、叶中均有表达；在NaCl胁迫处理12 h后，根、茎中桑树 NHX1的表达量显著增加，而后回落；而在胁迫处理24 h 后，叶中桑树 NHX1的表达量显著提高，随后回落。过量表达 MnNHX1的转基因拟南芥在 NaCl 胁迫环境中，种子发芽率低于野生型，而根长和侧根生长情况以及幼苗成活率都优于野生型；连续浇灌含高浓度 NaCl 营养液的转基因拟南芥生长状态更为优良。【结论】MnNHX1为优良的植物耐盐基因，在桑树中为组成型表达，并受NaCl胁迫诱导，表现出组织特异性。过量表达 MnNHX1的拟南芥耐盐能力显著提高，生存在盐胁迫环境中，依然具有良好的生长和发育能力。