5种主要海水养殖病原菌多重微流控荧光定量PCR快速检测技术的建立

S917.1; 在养殖现场开展多病原的快速检测是水产养殖产业健康发展的重要技术需求之一.本研究选取哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的vhhA 基因、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的toxR 基因、大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)的luxR基因、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)的empA基因和美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp.damselae)的Mcp基因作为靶基因,设计特异性引物,通过优化反应体系和条件,并在微流控芯片进行集成,建立了可同步检测这5种病原菌的多重微流控荧光定量PCR检测技术.结果显示,本研究所建立的检测技术最佳反应体系:2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL,Primer F/R 各 1 μL,DNA 模板 2 μL,ddH2O 1 μL.反应条件为 95℃30 s,95℃5s,61℃30 s,扩增30个循环.通过绘制标准曲线发现,在109～104copies/μL浓度范围内均有良好的线性相关性.该方法对哈维氏弧菌、副溶血弧菌、大菱鲆弧菌、鳗弧菌和美人鱼发光杆菌美人鱼亚种特异性强,对5种病原菌的最低检测限分别为40、20、200、500和20CFU/mL,显示出较高的灵敏度,且样品平均检测时间缩短至26min左右.本研究结果为开发水产养殖多病原快速、精准的现场检测技术奠定了重要基础.