蜡样芽孢杆菌亮氨酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达及重组酶性质

本研究采用PCR技术从蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus基因组DNA中克隆出亮氨酸脱氢酶基因，构建重组表达质粒pET280t（＋）-ldh，实现在大肠杆菌中的高效表达，并分析重组亮氨酸脱氢酶的酶学性质。结果表明，从Bacillus cereus成功克隆的亮氨酸脱氢酶编码基因约为1000bp，表达的重组亮氨酸脱氢酶相对分子质量约为40kDa。酶学研究结果表明：该酶的最适反应温度为37℃，其热稳定性好，30℃的半衰期长迭330h；最适反应pH为9．5；在pH7．0-8．0的缓冲液中保存24h后仍保持原有酶活力的80％以上；金属离子Fe2＋对该酶具有明显的促进作用，而EDTA强融抑制亮氨酸脱氢酶的活性。动力学分析结果表明该酶对底物NADH催化的km和Vmax。分别为0．635mmol／L和1．54μmol／（L·min）。亮氨酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的成功表达为手性氨基酸的生物合成提供了可能。