黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶基因的克隆及其在酵母中的表达

以A．niger TCCC41013总RNA为模板，通过RT-PCR扩增含自身信号肽的脯氨酸蛋白内肽酶基因pep，将其克隆到pUCm-T载体上进行测序。测序结果表明基因全长1581bp，共编码526个氨基酸，包括22个氨基酸的信号肽序列和504个氨基酸的成熟肽序列。通过生物信息学方法对蛋白质的理化性质进行分析预测，脯氨酸蛋白内肽酶等电点为4．43，具有丝氨酸活性中心，属丝氨酸羧肽酶S28家族。以重组质粒pUCm．T-pep为模板，通过PCR扩增去除自身信号肽的pep，构建毕赤酵母表达载体pPIC9-peP，电转酵母宿主菌GS115。SDS-PAGE分析显示表达产物的分子量为60000Da左右，酶特异性底物法测定酶活力最高可达2275．4mU／mL。