罗氏沼虾野田村病毒和十足目虹彩病毒1二重荧光定量PCR检测方法的建立及应用

S945.41; [目的]建立能同时检测罗氏沼虾野田村病毒(MrNV)和十足目虹彩病毒1(DIV1)的二重荧光定量PCR,为罗氏沼虾白尾病(WTD)及虹彩病毒病(DIV1D)的临床诊断和疫情监测提供更简便和高效的检测方法.[方法]分别根据MrNV-CP基因和DIV1-MCP基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,将目的基因片段分别克隆至pGM-T载体上制备重组质粒(pGM-T-CPMrNV和pGM-T-MCPDIV1),其中,pGM-T-CPMrNV用Sal I酶切后经体外转录获得MrNV标准品RNA,pGM-T-MCPDIV1则直接作为DIV1标准品DNA;以标准品为模板进行反应条件优化及标准曲线制定,建立可同时检测MrNV和DIV1的二重荧光定量PCR,并对该方法进行特异性、敏感性、重复性及临床应用试验.[结果]制备的MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA均具有很好的稳定性,可作为标准品和阳性对照使用;标准品起始模板范围为1.0×101～1.0×108 Copies/反应时,建立的标准曲线具有良好线性关系.优化后的二重荧光定量PCR灵敏度高,对标准品的检测灵敏度可达10 Copies/反应,对罗氏沼虾组织样品的检测灵敏度约10 Copies/mg;与其他虾类常见病原无交叉反应,且整个检测过程仅需1 h左右.二重荧光定量PCR检测MrNV的组内试验和组间试验变异系数分别为0.31％～0.93％和0.96％～1.33％,检测DIV1的组内试验和组间试验变异系数分别为0.35％～0.81％和0.78％～1.04％.应用建立的二重荧光定量PCR和国内现行有效标准的套式PCR分别对117份临床样品进行MrNV和DIV1检测,结果显示对MrNV和DIV1检测的符合率分别为99.15％和97.44％,且二重荧光定量PCR检测目标病毒拷贝数较低样品时较套式PCR具有更高的灵敏度.2020年广西罗氏沼虾样品MrNV和DIV1的阳性检出率分别为6.0％和11.0％.[结论]结合TaqMan-MGB探针技术建立的二重荧光定量PCR能同时检测MrNV和DIV1,且具有灵敏度高、特异性强、重复性好、简便快速的特点,可为WTD和DIV1D的临床诊断及实时监测提供技术保障.