C1009del突变质粒载体的构建及MYOC基因的有效干扰

目的 在前续课题基础上构建针对MYOC基因的RNAi慢病毒载体及C1009del突变质粒载体,并筛选出小梁网细胞作为后续转染阳性质粒合适的药物G418浓度,为下一步将突变质粒载体导入小梁网细胞使其表达突变蛋白,研究突变蛋白的功能、分泌特点等,进而研究原发性开角型青光眼的致病机制提供技术支持.方法 采用基因定向克隆方法 构建目的 基因过表达载体及4种RNAi慢病毒载体、凝胶电泳及基因测序验证;采用Western blot及基因测序方法 筛选有效的RNA干扰靶点;应用基因定点突变技术合成C1009del突变序列,构建突变质粒载体;培养小梁网细胞并用G418筛选.结果 经酶切和基因测序证实MYOC基因过表达载体、RNAi慢病毒载体及C1009del突变质粒载体构建成功,并筛选出PSC413为最有效的RNA干扰靶点;G418终浓度为400 μL/mL及更高浓度的孔细胞凋亡.结论 本实验构建的RNAi慢病毒载体能成功将正常MYOC基因干扰掉,并将G418为400 μL/mL作为后续小梁网细胞转染成功的最适筛选浓度,为本课题下一步将突变基因导入小梁网细胞进行突变蛋白的功能研究奠定基础.