早熟马铃薯ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为得出马铃薯ISSR-PCR最佳的反应体系,采用正交试验设计,对r Taq DNA聚合酶、Mg2＋、模板DNA、d NTPs和引物进行5因素4水平筛选。结果表明,马铃薯ISSR-PCR的最佳反应体系为：总体积25μL的反应体系中含有r Taq DNA聚合酶0.5 U、Mg2＋浓度为2.5 mmol/L、模板DNA用量为75 ng、d NTPs浓度为200μmol/L、引物浓度为0.8μmol/L。这些因素对PCR反应的影响大小顺序为Mg2＋浓度〉r Taq DNA聚合酶用量〉d NTPs浓度=引物浓度〉模板DNA用量。应用该最佳反应体系对39条ISSR引物进行筛选,得出15条条带清晰、条带数多、重复性好的引物。并通过退火温度梯度试验得出筛选引物的最佳退火温度。