基于纳米抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的一步酶联免疫吸附分析法检测黄曲霉毒素B1

从噬菌体展示的抗黄曲霉毒素B1(AFB1)纳米抗体文库中,通过四轮亲和淘选,得到抗AFB1纳米抗体G8.将编码纳米抗体G8的基因与碱性磷酸酶(AP)基因融合,构建了重组融合表达载体pET25b(+)-G8-AP,将其转化大肠杆菌BL21(Rosetta,DE3)感受态细胞,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导融合基因表达.SDS-PAGE结果表明,融合蛋白G8-AP为可溶性表达,Ni2+-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,对硝基苯磷酸二钠(pNPP)法测得纯化后的G8-AP的碱性磷酸酶比活力为(364.5±8.3)U/mg.ELISA检测结果表明,G8-AP具有特异识别AFB1的活性,与其它真菌毒素(AFB2、AFG1、AFG2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、伏马菌素B1)无交叉反应.基于G8-AP建立了检测AFB1的一步ELISA法.在优化的条件下,即甲醇浓度20％、盐离子浓度20 mmol/L、pH 7.4条件下,方法的半数抑制浓度(IC50)为19.8 ng/mL,线性范围为4.3 ～ 92 ng/mL,检出限为2.6 ng/mL.对玉米和小麦样品加标回收实验结果表明,基质对本方法的干扰不明显,可用于实际样品检测.