基于TRPM2/Akt/GSK3β通路探讨24-乙酰泽泻醇A保护脑缺血再灌注损伤脑微血管内皮细胞的机制

目的:探讨24-乙酰泽泻醇A(24A)改善小鼠脑缺血再灌注后脑微血管内皮细胞(BMECs)损伤的作用机制.方法:将45只雄性10周龄C57BL/6小鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、24A组,每组15只.模型组、24A组采用20 min双侧颈总动脉结扎后再灌注的方法构建小鼠脑缺血再灌注损伤(CI/RI)模型,假手术组小鼠只分离颈总动脉和迷走神经,不结扎.24 A组采用24 A灌胃,剂量为30 mg/(kg·d);假手术组和模型组则给予等体积的生理盐水进行灌胃,3组均灌胃1次/d,连续干预7 d.分别采用神经功能缺损评分(mNSS)评估小鼠神经功能受损程度;采用新物体识别测试(NORT)和水迷宫(MWM)评价小鼠认知功能;采用免疫荧光法检测内皮细胞CD31表达;采用Western blot法检测脑组织闭锁小带蛋白1(ZO-1)、闭合蛋白(Occludin)、紧密连接蛋白-5(Claudin-5)、磷酸化核因子κB(p-NF-κB)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、瞬时受体电位离子通道-2(TRPM2)、磷酸化苏氨酸蛋白激酶(p-AKT)、磷酸化糖原合成酶激酶-3(p-GSK3β)蛋白表达水平.结果:① 神经功能:与假手术组比较,模型组mNSS在第1、3、5、7天均明显升高(P＜0.05);与模型组比较,24A组第3、7天mNSS明显降低(P＜0.05).② 认知功能:与假手术组比较,模型组NORT 1、24 h识别指数明显降低(P＜0.05);与模型组比较,24A组NORT 1、24 h识别指数明显升高(P＜0.05).与假手术组比较,模型组干预后第2～4天逃避潜伏期明显延长,穿越目标平台次数明显减少(P＜0.05);与模型组比较,24A组干预后第3、4天逃避潜伏期明显缩短,穿越目标平台次数明显增加(P＜0.05).③ 内皮细胞CD31、ZO-1、Occludin、Claudin-5蛋白表达:假手术组CD31荧光表达较为密集,呈现红色荧光;与假手术组比较,模型组CD31荧光表达明显降低(P＜0.05);与模型组比较,24A组CD31荧光表达明显升高(P＜0.05).与假手术组比较,模型组ZO-1、Occludin、Claudin-5蛋白表达量明显下降(P＜0.05);与模型组比较,24A组ZO-1、Occludin、Claudin-5蛋白表达量明显升高(P＜0.05).④ p-N