棉铃虫幼虫中肠类胰蛋白酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

Q96; 根据昆虫类胰蛋白酶序列的保守性设计了一对引物,以棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫中肠总RNA反转录出cDNA第一链作为模板,利用RT-PCR,分离出了一种棉铃虫类胰蛋白酶(HaT)基因的cDNA序列.分析表明该cDNA序列的开放阅读框为696 bp,编码一个由231个氨基酸残基组成的多肽,推测的氨基酸序列具有His57、Asp102、Ser192组成的电荷中继网,决定胰蛋白酶底物专一性的Asp189,底物结合部位的Gly216和Gly226残基,及其它胰蛋白酶结构上的保守区域.氨基酸序列同源性比较表明:HaT同其它鳞翅目昆虫类胰蛋白酶有较高的同源性,同源性在44%～79%之间.为研究棉铃虫类胰蛋白酶基因(hat)编码产物的活性,将其插入原核表达载体pGEX4T-3和pET23b中,并在大肠杆菌中进行了诱导表达,结果表明,GST-HaT融合蛋白在大肠杆菌中进行了特异表达,非融合形式的表达产物HaT具有胰蛋白酶催化活性.