Plant cell bioreactors for peptide production

La producció de proteïnes recombinants en plantes representa una oportunitat per a la seva obtenció i utilització comercial. L'objectiu principal d'aquesta tesi industrial ha estat el desenvolupament de sistemes vegetals de producció de proteïnes, eficients i competitius econòmicament, amb possibilitats de portar-les al mercat. Per fer-ho hem explorat dos sistemes: els cultius cel·lulars de Daucus carota i les fulles de Nicotiana benthamiana, cadascun d'ells amb els seus avantatges i limitacions. Com a prova de concepte, ambdós sistemes van ser utilitzats per a la producció d'"insulin-like growth factor 1" (IGF1), un pèptid d'alt valor afegit per a les indústries cosmètica i farmacèutica. S'assajaren vàries estratègies innovadores per a millorar els rendiments de producció augmentant l'expressió gènica i reduir costos de purificació del producte. A més, l'activitat biològica de l'IGF1 i els seus derivats produïts en planta va ser avaluada en comparació amb pèptids sintètics. Com a primera estratègia s'assajaren supressors del silenciament de l'ARN d'origen viral per tal d'incrementar l'expressió gènica. En assajos d'expressió transitòria amb la proteïna verda fluorescent com a marcadora, seleccionàrem la proteïna P1b del ipomovirus Cucumber vein yellowing virus (CVYV). Els nostres resultats amb línies cel·lulars de pastanaga sobreexpressores de l'IGF1 o el seu pèptid derivat CPP-IGF1 (variant dissenyada per a millorar la seva penetració en cèl·lules humanes) mostraren que en combinació amb P1b s'arribava a rendiments de producció 4 vegades majors que les línies sense el supressor del silenciament. A més, els pèptids foren dirigits al medi de cultiu per facilitar el seu aïllament mitjançant una simple clarificació. En assajos d'activitat, les fraccions obtingudes confirmaren ser capaces d'incrementar la divisió de fibroblasts humans. En relació amb l'estabilitat de la producció, s'observà una reducció propera al 33% després de vint-i-un cicles de propagació successius, per la qual cosa s'implementà la criopreservació de les línies transgèniques per mantenir els rendiments de producció originals, i així establir bancs cel·lulars per usos futurs. Alhora, es desenvolupà un sistema de producció transitòria de l'IGF1 i el CPP-IGF1 en fulles de N. benthamiana utilitzant un vector derivat del virus del mosaic del tabac, Tobacco mosaic virus (TMV). Aquest sistema va permetre reduir el temps d'obtenció del pèptid actiu, encara que en comparació amb la producció a le