Model-based design and development of operational strategies for Rhizopus oryzae lipase production in Pichia pastoris under the AOX1 promoter

Pichia pastoris es identificada como una de las factorías celulares más eficientes para la producción de proteínas recombinantes. Más de 500 proteínas han sido expresadas usando este sistema de expresión. P. pastoris combina la habilidad de crecer en medios mínimos a altas densidades celulares con la de secreción de proteína heteróloga, ayudando a su recuperación. En este trabajo, la proteína modelo seleccionada es la lipasa recombinante de Rhizopus oryzae (ROL). La producción heteróloga de ROL en cultivos fed-bach de P. pastoris PAOX1 (Mut+) ha sido estudiada desde el punto de vista de la monitorización y control del bioproceso, la modelización cinética y el diseño y desarrollo de estrategias operacionales. El primer paso en la investigación ha sido la estimación de la concentración de biomasa, sustrato y velocidad específica de crecimiento (μ) mediante dos observadores no lineales y uno lineal. El objetivo de este estudio ha sido comparar las prestaciones de los diferentes algoritmos en bioproceso de P. pastoris. La producción de proteína recombinante está estrechamente relacionada con la μ. Por lo tanto, debido a su elevada relevancia en el bioproceso, μ fue estimada utilizando el análisis de los gases de salida en línea o las medidas de la concentración de sustrato. La biomasa y el sustrato fueron obtenidos directamente de sus correspondientes balances de materia. La estrategia de cultivo más frecuentemente utilizada para conseguir altas densidades celulares y elevada producción de proteína heteróloga con el sistema PAOX1 (Mut+) es la operación fed-batch. Las estrategias operacionales estándar están basadas en el control de la concentración de sustrato próximas a cero (estrategias limitantes) o manteniendo la concentración a un valor contante (estrategias no limitantes). En consecuencia se estudió el efecto de las estrategias operacionales fed-batch de metanol no limitante (MNLFB) y metanol limitante (MLFB) en la producción de ROL. Éstas son las estrategias de control más comunes que tienen como objetivo mantener contantes las velocidades específicas claves: crecimiento celular (μ), consumo de sustrato (qs) y producción de proteína (qp) a partir de la hipótesis de estado quasiestacionario para el sustrato. Los resultados se analizaron con el objetivo de determinar la condición más apropiada en función de rendimientos y productividades. Las velocidades específicas medias y las variables de estado para varios cultivos fedbatch, bajo condiciones de metano