Estandarización y validación de la técnica RT-PCR cualitativa en tiempo real para la detección del virus de la peste porcina clásica

Se estandarizó y validó la técnica de Transcriptasa Reversa--Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-T-PCR) en tiempo real para el diagnóstico de la Peste Porcina Clásica (PPC). Se utilizó extractos de tonsilas y nódulos linfáticos de porcinos positivos (n=36) y negativos (n=30) a PPC mediante inmunofluorescencia (IF). La extracción de ARN viral, síntesis del ADN complementario y PCR en tiempo real se realizaron utilizando kits comerciales. Se utilizaron tres pares de cebadores para amplificar una región conservada (5'UTR) del virus PPC (VPPC) y del panpestivirus (virus de la DVB y EF) y una región codificante de la proteína E2 del VPPC frente a cepas de referencia del VPPC Alfort/187, Brescia y cepa China vacunal como controles positivos y cepas de los virus diarrea viral bovina, enfermedad de la frontera y rotavirus porcino como controles negativos. El 83.3 [+ ó -] 12.3% (30/36) de las muestras positivas al VPPC por IF resultaron positivas al aislamiento y el 96.7 [+ ó -] 3.3% (29/30) de las muestras negativas al VPPC por IF fueron negativas al aislamiento. Los resultados de la técnica de RT-PCR en tiempo real se determinaron mediante el análisis de las curvas de amplificación y disociación entre los controles positivos, negativos y las muestras de tejidos positivos y negativos al VPPC. Los cebadores E2 del VPPC dieron mejores resultados al reconocer los controles positivos y negativos. La técnica RT-PCR en tiempo real fue capaz de detectar al menos 4.28 pg de ARN de la cepa Brescia de la PPC. La validación se realizó comparando los resultados de las muestras positivas y negativas al aislamiento viral con los resultados de la RT-PCR en tiempo real. La prueba tuvo una sensibilidad de 96.8 [+ ó -] 6%, y especificidad de 82.9 [+ ó -] 12%, un valor predictivo positivo de 83.3 [+ ó -] 12.3%, y negativo de 96.7 [+ ó -] 3.3%. La técnica RT-PCR en tiempo real es una herramienta diagnóstica con alta sensibilidad y especificidad para el diagnóstico de la PPC.