Specific fluorescent labeling of α 2-macroglobulin-bound proteases: accessibility and localization of their active site within the complex

Pyrenebutylmethylphosphonofluoridate reacts with trypsin and elastase to yield a conjugate with a stoichiometry of one fluorescent label per enzyme molecule as already observed with chymotrypsin [1]. The kinetics of inactivation indicate that the serine active center of the proteases is involved in the labeling reaction. The binding of the proteases to α 2-macroglobulin does not modify the specificity of the reaction but drastically diminishes the labeling rate which also depends upon α 2-macroglobulin protease binding ratio. Dynamic quenching of the conjugated pyrene moiety by acrylamide, and iodide ions is markedly reduced upon reaction of the protease with α 2-macroglobulin, indicating a reduced accessibility of the protease active center in the complex. Singlet-singlet energy transfer measurements from the donor pyrene labeled active center of the proteases to the α 2-macroglobulin acceptor labeled thiol groups which are liberated upon protease fixation, gave a rough estimate of the distance (about 25 ) between the active center of the two α 2-macroglobulin bound protease molecules. Le pyrènebutylméthylphosphonofluoridate se fixe, en conditions stoechiométriques (1/1) sur la trypsine et sur l'élastase. Le dérivé fluorescent obtenu inactive spécifiquement le site catalytique des sérine-protéases, ce qui avait déjà été observé sur la chymotrypsine [1]. Les cinétiques d'inactivation par ce pyrène sont fortement ralenties lorsque l'enzyme est associé à l'α 2-macroglobuline (α 2M); la réactivité de ce marqueur dépend du nombre de protéases liées à l'α 2M, sans toutefois que sa spécificité vis-à-vis du centre actif de ces enzymes soit affectée. Le quenching dynamique de cette sonde fluorescente par l'acrylamide ou par les ions iodures est réduit de façon significative lorsque la protéase est liée à l'α 2M, l'accessibilité du centre actif est donc plus faible dans le cas où la protéase est complexée avec l'α 2M. Des mesures de transfert d'énergie singulet-singulet du centre actif des protéases marqué au pyrène vers un accepteur lié aux groupes-SH rendus accessible après action de ces protéases donnent une distance approximative de 25entre les centres actifs de deux molécules d'enzymes liées à l'α 2M.