Nontransformed rabbit liver glucocorticoid receptor: purification, characterization and transformation

La forme non transformée du récepteur à glucocorticoïdes du foie de lapin a été purifiée environ 8 000 fois grâce à un protocole en trois étapes. La première étape a été réalisée par précipitation au sulfate de protamine permettant une purification de 5–6 fois avec un rendement de 85 %. La seconde étape par chromatographie d'affinité sur N-(12-dodecyl-amino) 9 α-fluoro-16 α-méthyl-11 β, 17 α-dihydroxy-3-oxo-1,4-androsta-diène-17 β-carboxamide Sepharose a apporté un facteur de purification de l'ordre de 1 500 à 2 000 fois. L'étape finale mettant en œuvre la chromatographie d'exclusion haute performance aboutit à un facteur de purification voisin de 8 000 fois. La fraction obtenue s'est révélée pure à 60 %. Le récepteur purifié sous forme non transformée possède un coefficient de sédimentation de 9 S en gradient de sucrose 5–20 % préparé en tampon phosphate 0,16 M, un rayon de Stokes de 6,1–6,3 nm en gel filtration conventionnelle et haute performance. La spécificité de liaison du récepteur purifié est identique à celle déterminée sur des préparations cytosoliques. La chromatographie sur échangeurs d'ions et l'isofocalisation ont montré que la purification affecte la charge globale de la protéine. Ce phénomène pourrait être dû à des interactions entre le récepteur et des facteurs cytosoliques. L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide, en conditions dénaturantes, a montré une bande majeure M r = 94 000 en parfait accord avec les valeurs précédemment décrites pour d'autres récepteurs à glucocorticoïdes. Après élimination du molybdate puis exposition à 25°C en présence de 0,4 M KCl, le récepteur purifié reste transformable. La caractérisation des formes moléculaires transformée et non transformée a été réalisée grâce à la mesure de la liaison à des noyaux isolés, à l'affinité vis-à-vis des échangeurs anioniques et par HPLC. Les résultats montrent que, dans ces conditions, 40 % du récepteur purifié est transformé. The molybdate-stabilized nontransformed form of the glucocorticoid receptor from rabbit liver has been purified approximately 8,000-fold by a three-step procedure. The first step involved protamine sulfate precipitation which allowed a 5-6-fold purification with 85 % yield. The second step, affinity chromatography using a N-(12-dodecyl-amino) 9 α-fluoro-16 α-methyl-11 β, 17 α-dihydroxy-3-oxo-1,4-androstadiene-17 β-carboxamide substituted Sepharose gel, purified the receptor 1,500–2,000-fold as calculated by specific radioactivity. The third step invo