Application of synthetic oligonucleotides to the diagnosis of human genetic diseases
Dans des conditions adéquates les sondes d'hybridation d'oligonucléotides synthétiques font essentiellement montre d'une spécificité absolue d'hybridation. C'est-à-dire que chaque nucléotide doit former une paire de bases selon Watson et Crick pour que la sonde puisse former...
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Veröffentlicht in: | Biochimie 1985-01, Vol.67 (7), p.755-762 |
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Hauptverfasser: | , , |
Format: | Artikel |
Sprache: | eng |
Schlagworte: | |
Online-Zugang: | Volltext |
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Zusammenfassung: | Dans des conditions adéquates les sondes d'hybridation d'oligonucléotides synthétiques font essentiellement montre d'une spécificité absolue d'hybridation. C'est-à-dire que chaque nucléotide doit former une paire de bases selon Watson et Crick pour que la sonde puisse former un duplex stable. Toute pair de bases qui n'est pas selon Watson et Crick, y compris G-T, a un effet déstabilisant. Il est ainsi possible de choisir des conditions strictes d'hybridation telles que, alors qu'un duplex parfaitement apparié se formera entre un oligonucléotide et un DNA complémentaire, les duplex contenant une erreur d'appariement à une ou plusieurs positions ne se formeront pas. Des mutations dans une seule base de la séquence du DNA d'un gène peut provoquer, et provoque effectivement, des maladies génétiques. L'hybridation d'oligonucléotides à la région du DNA contenant ces changements de base serait affectée par les mutations et, par conséquent, l'hybridation d'oligonucléotides donne un moyen de déceler le changement d'une seule base.
Pour tenter de développer une méthode non-radioactive pour déceler les maladies génétiques humaines, nous avons préparé des oligonucléotides biotinylés par une méthode enzymatique. Une sonde oligonucléotidique (23-mer) contenant un seul résidu désoxyuridine biothinylé à son extrémité 3′ a été préparée par une réaction d'extension de l'amorceur en utilisant le DNA polymérase I d'
E. coli (fragment de Klenow); La sonde a pu être spécifiquement et fermement attachée avec de l'avidine D dans NaCl 1 M. Elle a pu être hybridé à un plasmide de DNA contenant 5 bases non complémentaires consécutives. La sonde biothinylée hybridée a pu être visualisée par l'avidine D et la phosphatase alcaline biotinylée, même lorsque nous avons utilisé 1,8 ng du plasmide du DNA (0,5 fmol). Nous décrivons une approche générale de la synthèse enzymatique d'oligonucléotides contenant une seule désoxyuridine biotinylée à son extrémité 3′.
Under appropriate conditions synthetic oligonucleotide hybridization probes display essentially absolute hybridization specificity. That is, every nucleotide must form a Watson-Crick base pair in order that the probe forms a stable duplex. All of the non-Watson-Crick base pairs, including G-T, have a destabilizing effect. Thus, it is possible to choose stringent conditions of hybridization such that, while a perfectly matched duplex between an oligonucleotide and complementary DNA will form, duplexes mismatched at one or more positio |
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ISSN: | 0300-9084 1638-6183 |
DOI: | 10.1016/S0300-9084(85)80164-4 |