CLONING, EXPRESSION, AND CHARACTERIZATION OF THE NUCLEO CAPSID PROTEIN OF INFECTIOUS BRONCHITIS VIRUS IN ESCHERICHIA COLI AND PICHIA PASTORIS

The nucleocapsid protein (N) gene (1,230 bp) of the M41 strain of infectious bronchitis virus (IBV) was amplified by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), and cloned in two systems; pET28a Escherichia coli and pFLD Pichia pastoris. The recombinant expression constructs (pET28a-N or pFLD-N) were identified by PCR and sequencing analysis. The transformant clones of BL21 strain of E. coli or GS115 of P. pastoris were submitted to appropriate inducting protocols. Expression of histidine-tagged fusion N proteins with a molecular mass of 54 kDa was determined by SDS-PAGE and Western blotting analysis, confirming that both recombinant N proteins were comparable in size and antigenicity to native IBV N protein. The E. coli system overexpressed the recombinant N protein, while the P. pastoris system produced a low yield of this recombinant protein. The bacteria expressed N protein was purified by chromatography on nickel-sepharose resin. These results indicated that the pET28a E. coli expression system is more effective to generate N recombinant protein for using as an antigen to detect anti-IBV antibodies in immuno-assays for this viral infection.Original Abstract: O gene da proteina de nucleocapsideo (1.230 pb) da estirpe M41 do virus da bronquite infecciosa (VBI) foi amplificado pelas reacoes de transcricao reversa e em cadeia da polimerase (RT-PCR) e clonado, em seguida, em dois sistemas; pET28a - Escherichia coli e pFLD - Pichia pastoris. Os produtos recombinantes construidos para expressao (pET28a-N ou pFLD-N) foram identificados por analises de PCR e de sequenciamento de nucleotideos. Os clones transformantes da linhagem BL21 de E. coli e da linhagem GS115 de P. pastoris foram submetidos aos protocolos apropriados de inducao. A expressao da proteina N de fusao com etiqueta de poli-histidina e com massa molecular de 54 kDa foi determinada pelas tecnicas de SDS-PAGE e de Western blotting, confirmando-se que ambas proteinas N recombinantes apresentaram tamanhos e antigenicidade compativeis com a proteina N nativa do proprio VBI. O sistema E. coli expressou uma quantidade relevante da proteina N recombinante, enquanto que o sistema P. pastoris produziu uma baixa recuperacao dessa proteina recombinante. A proteina N recombinante gerada pelo sistema bacteriano foi purificada em resina de niquel-sepharose. O conjunto de resultados indica que o sistema de expressao constituido por pET28a - E. coli e mais efetivo para produzir a proteina N recombi