Purification and properties of an endo-β-1,4-glucanase from Clostridium thermocellum

Clostridium thermocellum, bactérie anaérobie thermophile, dégrade la cellulose grâce à l'excrétion d'enzymes hydrolytiques que l'on retrouve dans le milieu sous forme de complexes ou d'agrégats. Jusqu'à présent, les composants de ces complexes ou agrégats n'ont pu être isolés. Dans cet article, nous décrivons une méthode de purification d'une endo-β-1,4-glucanase extracellulaire, qui est fondée sur l'utilisation d'une chromatographie sur QAE-Sephadex A50 en présence d'urée 6M. L'enzyme, caractérisée par son aptitude à hydrolyser la carboxyméthylcellulose trinitrophénylée, est une protéine monomérique de masse moléculaire 56.000. Le point isoélectrique est 6,2 et le pH optimum 6,0. La carboxyméthylcellulose est hydrolysée six fois plus rapidement que la cellulose non modifiée. Les produits terminaux de l'hydrolyse de la cellulose sont le glucose, le cellobiose et le cellotriose avec formation intermédiaire de cellotetraose. A forte concentration, le cellobiose, et à un moindre degré, le glucose, inhibent partiellement l'activité de l'enzyme. Aucun activateur ou inhibiteur spécifique de faible poids moléculaire n'a pu être mis en évidence. Bien que C. thermocellum soit un anaérobie strict, l'enzyme n'est pas sensible à l'oxygène. En revanche, le caractère thermophile de la bactérie se retrouve dans le comportement de l'enzyme vis-à-vis de la température. The extracellular cellulolytic enzymes of the thermophilic anaerobe Clostridium thermocellum occur as a protein complex or aggregate which, until now, has not been resolved into individual enzyme components. By using QAE-Sephadex A50 chromatography in the presence of 6 M urea, it was possible to split the complex into distinct protein fractions. One of these fractions contained an endo-β-1.4-glucanase which was isolated at a high degree of purity and was identified by its ability to hydrolyze trinitrophenylated carboxymethylcellulose. The enzyme is of monomeric nature, with a molecular weight of 56,000. It has an isoelectric pH of 6.2 and an optimum pH of 6.0. It hydrolyzed carboxymethylcellulose and, at a slower rate, cellulose powder. The major end products of cellulose degradation are glucose, cellobiose and cellotriose; cellotetrose is formed as an intermediate product No specific small molecular weight activator or inhibitor was found except cellobiose and, to a lesser extent, glucose, which at high concentrations partially inhibit the activity of the enzyme. The temperature dependence of the enzyme is