Biomolecular evaluation of cryopreserved amniotic membranes for ophthalmological use by ELISA and RT-PCR at one and eighteen months

To study the presence of certain proteins - EGF (epidermal growth factor), KGF (keratinocyte growth factor), IL-10 (interleukin 10), HGF (hepatocyte growth factor), Alpha2-macroglobulin and IL-1RA (interleukin 1 receptor antagonist) in cryopreserved amniotic membranes at 1 and 18 months and, as a secondary objective, to detect mRNA corresponding to KGF, IL-1Ra, Alpha2-macroglobulin, Fas Ligand, TGF beta (transforming growth factor beta) and Lumican by RT-PCR in membranes preserved at 1 and 18 months. Four samples of amniotic membrane were divided into 2 groups: the first group (N=2) cryopreserved for 1 month and the second group (N=2) cryopreserved for 18 months, in order to be studied by RT-PCR and ELISA. RT-PCR detected KGF, IL-1Ra, Alpha2-macroglobulin, Fas Ligand, and Lumican. Of these, FAS Ligand mRNA was found in samples preserved for 1and 18 months. KGF, Lumican, and alpha2-microglobulin mRNA were found only at 1 month, and IL-1Ra mRNA was absent in both sample groups. RT-PCR for TGF-beta was inconclusive. ELISA was performed for detection and quantification of 6 proteins (EGF, KGF, IL-10, HGF, Alpha2-macroglobulin and IL-1Ra) in both amniotic membrane groups. All 6 proteins were found in all samples, with a lower concentration at 18 months compared to 1 month of preservation. This study shows that membranes cryopreserved in 50% glycerol for 18 months do retain the proteins necessary for regeneration of the corneal surface, giving these membranes their biochemical properties. Étudier la présence protéique par ELISA de l’EGF (facteur de croissance épidermique), du KGF (facteur de croissance des kératinocytes), de l’IL-10 (interleukine 10), de l’HGF (facteur de croissance hépatocytaire), de l’Alpha2-macroglobuline et de l’IL-1RA (antagoniste des récepteurs de l’interleukine 1) dans des membranes amniotiques cryoconservées à 1 et 18 mois ; et, comme objectif secondaire, de détecter la présence de l’ARNm correspondant au KGF, à l’IL-1Ra, à l’Alpha2-macroglobuline, au Fas Ligand, au TGF (transforming growth factor beta) et au Lumican par RT-PCR dans des membranes conservées à 1 et 18 mois. Quatre échantillons de membrane amniotique ont été répartis en 2 groupes: le premier groupe (n=2) cryoconservé pendant 1 mois et le deuxième groupe (n=2) cryoconservé pendant 18 mois à fin d’être étudiés par RT-PCR et ELISA. La RT-PCR a détecté la présence du KGF, de l’IL-1Ra, de l’Alpha2-macroglobuline, du Fas Ligand et du Lumican. Parmi ceux-ci, l’ARNm du Fas Ligand