A modified two primer approach to oligonucleotide-directed in vitro mutagenesis

Utilisant la mutagénèse dirigée d'oligonucléotides, nous nous sommes efforcés de définir les caractéristiques de la structure protéique ayant une importance dans l'attachement du DNA et de l'AMP cyclique par le CAP d' E. coli, l'activité enzymatique et l'attachement putatif du DNA de la réductase dihydrofolate de L. casei, et les régions fonctionnellement importantes du RNA auto-excision de l'intron r-RNA de Tetrahymena thermophila. Nous avons utilisé une modification de la méthode décrite par Norris et coll. [1]. Une amorce mutagène et une amorce M13 universelle de mise en séquence sont simultanément fixées à une matrice d'un clone M13 contenant le DNA à mutagéniser, puis, après extension du brin de DNA, le fragment est découpé et re-cloné dans des vecteurs M13 ou plasmides. Nous avons analysé l'effet sur la fréquence de mutation de: o 1) la température utilisée pour l'extension du brin; 2) la classe du changement de base tenté; 3) le système de réparation d'erreurs d'appariement de l'hôte. Un système récemment développé pour la détection phénotypique de mutations dans l'intron Tetrahymena nous a aidé à déterminer les fréquences de mutation. Using oligonucleotide-directed mutagenesis, we are trying to define the features of the protein structure that are important for the DNA and c-AMP binding by CAP from E. coli, the enzymic activity and putative DNA binding of dihydrofolate reductase of L. casei, and the functionally important regions of the self-splicing RNA of the r-RNA intron of Tetrahymena thermophila. We have used a modification of the method described by Norris et al. [1]. A mutagenic primer and an M13 universal sequencing primer are annealed simulaneously to a template from an M13 clone containing the DNA to be mutagenised and, after DNA strand extension, the fragment is cut out and recloned into either M13 or plasmid vectors. We have analysed the effect on the frequency of mutation of: o 1) the temperature used for strand extension; 2) the class of base change attempted; 3) the host mismatch repair system. A recently developed system for phenotypic detection of mutations in the Tetrahymena intron aided in determining mutation frequencies.