Modifikation der Regioselektivität einer P450‐Monooxygenase ermöglicht die Synthese von Ursodeoxycholsäure durch die 7β‐Hydroxylierung von Lithocholsäure

Wir haben die P450‐Monooxygenase CYP107D1 (OleP) aus Streptomyces antibioticus für die stereo‐ und regioselektive 7β‐Hydroxylierung von Lithocholsäure (LCS) zur Herstellung von Ursodeoxycholsäure (UDCS) durch “Protein‐Engineering” angepasst. OleP wurde zuvor für die Hydroxylierung von Testosteron an der 7β‐Position beschrieben, hydroxyliert jedoch LCS ausschließlich an der 6β‐Position, wodurch Murideoxycholsäure (MDCS) gebildet wird. Struktur‐ und 3DM‐Analysen, sowie molekulare Modellierungen wurden verwendet, um die Aminosäurereste F84, S240 und V291 als spezifitätsbestimmend zu identifizieren. Durch einen Alaninscan wurde S240A als UDCS‐produzierende Variante identifiziert. Basierend auf den identifizierten Positionen wurde eine synthetische “small but smart” Bibliothek durch die Verwendung eines farbbasierten Assays auf UDCS Produktion getestet. Hier konnte eine beinahe perfekte regio‐ und stereoselektive Dreifachvariante (F84Q/S240A/V291G) identifiziert werden, die UDCS in einer 10‐fach höheren Menge produziert als die S240A Variante. Der hergestellte Biokatalysator eröffnet neue Möglichkeiten zur umweltfreundlichen Synthese von UDCS aus dem Abfallprodukt LCS. Wir berichten über das Protein‐Engineering der P450‐Monooxygenase CYP107D1 für die stereo‐ und regioselektive 7β‐Hydroxylierung von Lithocholsäure (LCS) zur Herstellung von Ursodeoxycholsäure (UDCS). Selektivitätsbeeinflussende Reste wurden identifiziert und eine „small but smart“ Mutantenbibliothek erstellt. Durch einen farbbasierten Schnelltest konnte eine Variante mit nahezu perfekter Regio‐ und Stereoselektivität gefunden werden.