Разработка тестов на основе аллель-специфической ПЦР для детекции распространенных мутаций в гене трансмембранного регуляторного белка муковисцидоза

Цель работы состояла в разработке диагностических методик, основанных на принципе аллель-специфической ПЦР для анализа распространенных мутаций в гене ТРБМ с использованием двух подходов: традиционной ПЦР c дальнейшим разделением продуктов в гель-электрофорезе и ПЦР в реальном времени. Методы. Для исследований выбраны следующие мутации – dF508, W1282X, R117H, 621 + 1G > T, 2143delT с частотой встречаемости в Украине: dF508 – 43,3 %; 2143delT – 1,38 %; W1282X – 1,1 %; R117H и 621 + 1G > T – < 0,6 %. Использованы контрольные образцы ДНК с соответствующими мутациями, идентифицированные методами гетеродуплексного анализа и ПДРФ-анализа. Результаты. Проведен дизайн и оптимизированы условия аллель-специфической амплификации для анализа мутаций dF508, W1282X, R117H, 621 + 1G > T, 2143delT. Разработанные методики анализа подтверждены проверкой контрольных образцов ДНК с мутациями W1282X (n = 3), R117H (n = 2), 621 + 1G > T (n = 1), 2143delT (n = 1). Для проверки теста на dF508 проанализированы 100 носителей данной мутации в гетерозиготном состоянии и 50 – в гомозиготном состоянии. С помощью разработанной методики детекции 2143delT проанализированы также 48 пациентов, больных муковисцидозом, у которых первично выявлено лишь по одной мутации вместе с неизвестным мутантным вариантом. В результате анализа среди них определены еще четырее носителя указанной делеции в гетерозиготном состоянии. При этом не найдено отличий в данных, полученных с использованием стандартных протоколов анализа этих мутаций. Выводы. Показано, что метод аллель-специфической ПЦР является быстрым и относительно недорогим, его можно применять для детекции известных мутаций в гене ТРБМ.