배양된 망막신경절세포주에서 허혈전처치와 Protein kinase C의 역할

목적: Staurosporin으로 분화시킨 retinal ganglion cell (RGC)-5 세포에서 허혈전처치의 산화스트레스에 대한 세포보호효과와 protein kinase C (PKC) 아형 발현과의 관계를 알아보고자 하였다. 대상과 방법: RGC-5를 in vitro로 배양하면서 Staurosporin 처리 농도와 시간을 바꾸어가면서 RGC-5를 형태학적으로 충분히 분화시키는 최소 농도와 시간을 결정하였다. 여기서 얻어진 조건으로 분화시킨 RGC-5 세포에 800 μM 과산화수소수(H2O2)를 15시간 처리하여 산화스트레스를 야기하여 세포독성을 일으켰다. 이때 0.3% 산소 허혈로 시간을 달리하면서 허혈전처치를 시행하여 허혈전처치의 산화스트레스에 대한 세포보호효과 특성을 알아보았다. 그리고 가장 보호 효과가 큰 허혈전처치를 시행한 후 시행전, 후 1시간, 2시간, 15시간 24시간 후의 PKC 아형 효소 α, β, γ, δ, ε, ζ의 mRNA와 단백질의 변화를 관찰하였다. 결과 : Staurosporin 처치 후 RGC-5의 축삭돌기가 증가하여 형태상 신경세포와 유사해지는 것을 관찰할 수 있었고, 이러한 변화가 충분히 일어나는 staurosporine의 최소 처리 농도와 처리 시간이 2 μM, 1시간임을 확인하였다. 이후 800 μM 과산화수소수를 이용한 산화스트레스를 가했을때 8시간의 허혈전처치시 LDH assay에서 가장 큰 세포보호효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이때 허혈전처치 전후의 PKC 아형효소의 mRNA와 단백질 발현에서의 변화는 PKC α, ε에서 허혈전처치 2시간 후 허혈시행전에 비해 증가소견을 보였다. 결론: Staurosporin으로 분화시킨 RGC-5세포에서 허혈전처치가 산화스트레스에 대한 세포보호효과를 가짐을 확인할 수 있었고 이러한 허혈전처치 전후의 PKC α, ε 아형효소 발현이 증가하는 것으로 미루어 허혈전처치의 세포보호효과가 PKC α, ε 아형효소와 연관이 있을 가능성이 있음을 시사한다고 생각한다. Purpose: To investigate the cellular protective effects of hypoxic preconditioning against oxidative stress in a staurosporine-differentiated RGC-5 cell line and the relevance of protein kinase C subtype expression. Methods: The minimum staurosporine concentration and exposure time necessary to morphologically fully differentiate RGC-5 cells were determined. Cytotoxic injury was provided by oxidative stress with 800 ?M hydrogen peroxide (H2O2) for 15 hours to morphologically fully-differentiated cells. The cytoprotective effect of hypoxic preconditioning was found by exposing the cell line to 0.3% oxygen for different periods of time. Quantifiable changes in the expression of mRNAs and proteins of the isoenzymes α, β, γ, δ, ε, ζ of protein kinase C were determined before and after 1, 2, 15, and 24 hours of hypoxic preconditioning. Results: Axonal growth in RGC-5 cells after the induction of differentiation with staurosporine caused these cells to resemble neurons. The minimal concentration and exposure time to staurosporine that evoked full differentiation of RGC-5 cells was exposure to 2 μM staurosporine for 1 hour. An LDH assay demonstrated that hypoxic preconditioning had neuroprotective effects against hydrogen peroxide-induced oxidative stress. Protein and mRNA levels of PKC isoforms α and ε increased after preconditioning. Conclusions: Hypoxic preconditioning of staurosporine-differentiated RGC-5 cells had a cytoprotective effect against oxidative stres