사람의 부분 췌장으로부터 분리한 췌관세포를 이용한 베타세포의 분화에 관한 연구

연구배경: 췌도이식은 시술 방법이 간단하고 반복 이식이 가능하다는 장점이 있어 제1형 당뇨병의 유망한 근치적 치료법으로 간주되고 있다. 그러나 현재 췌도이식에 필요한 췌도 공급이 절대적으로 부족한 상태이므로 췌도이식이 당뇨병환자의 보편적인 치료방법으로 자리잡기 위해서는 췌도이식원의 충분한 확보가 선행되어야 한다. 대체 췌도이식원(alternative islet source)에 대한 연구는 다양한 방법을 통하여 활발히 진행되고 있는데, 췌관세포(pancreatic duct cell)를 이용한 세포대치요법이 그 중 한가지이다. 본 연구에서는 사람의 부분 췌장으로부터 췌관세포를 분리, 배양하는 기술을 확립하고 췌관세포로부터 베타세포의 분화를 유도하는 실험실 조건을 찾고자 하였다. 방법: 비당뇨인 환자로부터 췌장수술 시 제거된 정상췌장의 일부(1~3 g)를 확보하고 장기 보존액으로 세척한 후 췌장의 크기에 따라 collagenase P를 췌장의 실질 내로 여러번 주입하였다. 췌관세포가 풍부한 세포를 분리한 후 10% FBS가 포함된 CMRL 배양액에서 분주하고 배양하였다. 결과: 췌관세포는 단층 상태로 1~2주 후 배양용기에 가득 자랐으며 이때에 면역염색검사상 90% 이상이 cytokeratin7 양성인 췌관세포임을 확인하였다. 이후에는 혈청이 포함되지 않은 DMEM/F12 배양액으로 교체하고 베타세포의 분화를 유도하기 위하여 Matrigel, exendin-4, cholera toxin, forskolin 등을 처리하였다. 그 결과, 면역염색검사 및 RT-PCR 검사에서 베타세포로의 분화가 이루어졌음을 확인하였으나 효율이 매우 낮았다. 또한 일부췌관세포에서는 전사인자인 neurogenin3을 아데노바이러스를 통하여 과발현시켰으나 베타세포의 분화를 현저히 촉진시키지는 못했다. 결론: 사람의 부분 췌장으로부터 췌관세포를 성공적으로 분리, 배양하여 베타세포로의 분화를 유도할 수 있는 실험 모델을 확립할 수 있었다. 그러나 베타세포의 분화 효율이 낮아 이에 대한 프로토콜의 개선이 요구된다. Background: Despite a recent breakthrough in human islet transplantation for treating diabetes mellitus, the limited availability of insulin-producing tissue is still a major obstacle. This has led to a search for alternative sources of transplantable insulin-producing cells including pancreatic duct cells. We aimed to establish in vitro culture of pancreatic duct cells from a partial pancreas tissue in human, which could be harnessed to differentiate into pancreatic β cells. Methods: We isolated pancreatic duct cells from small pieces of pancreas tissue (1~3 g) derived from non-diabetic humans (n = 8) undergoing pancreatic surgery due to cancer. Pancreas tissue was finely minced after injection of collagenase P into the parenchyma. The mince was incubated in a shaking water bath at 37℃ for 25 min and passed through a 150 μm mesh. The released cells were recovered, washed, and plated in a dish containing CMRL culture medium with serum. Results: Isolated pancreatic cells grew in monolayer and became confluent in 1~2 wks showing typical epithelial cobblestone morphology. Immunochemistry demonstrated that ~90% of the cultured cells were cytokeratin7-positive duct cells. To induce β cell differentiation, the cells were incubated in DMEM/F12 culture medium without serum. In addition, treatment with Matrigel overlay, exendin-4, cholera toxin or forskolin was done. Though β cell differentiation was found by immunostaining and RT-PCR, the differentiation efficiency was ver