인슐린 종 細胞에서 高濃度 葡萄糖에 의한 遊離基 생성증가

연구배경: 산화 스트레스는 고농도 포도당에 의한 당뇨병성 합병증 발생에 주요인으로 작용하는 것으로 생각되고 있으며 이에 본 연구자들은 고농도 포도당에서 생쥐인슐린종(MIN6N8a) 세포를 배양하여 항산화 효소활성도를 측정하고 세포 유리기 생성량을 측정함으로서 췌장 베타세포의 산화스트레스에 미치는 고농도 포도당의 영향을 관찰하고자 하였다. 실험방법: 포도당이 Mouse insulinoma(MIN6N8a)세포 항산화 효소 활성도에 미치는 영향을 알기 위해서 실험군을 고농도 포도당군과 정상농도 포도당군으로 나누어 각각 포도당을 첨가하여 배양한 후 세포를 수집하여 항산화 효소 활성도등을 측정하였고 MTT에 의한 MIN6N8a 세포 독성을 측정하였으며 MIN6N8a 세포의 반응성 산소 생성량을 측정하였다. 결과: MIN6N8a세포를 5.6mM 포도당과 22.4mM 포도당 함유 배양액으로 각각 1~6일간 배양한 후 항산화 효소 즉 CuZn-SOD, Mn-SOD, catalase 및 GSHPx 를 측정한 결과 catalase와 GSHPx 활성도는 포도당 농도의 차이에 의한 효소 활성도 차이를 나타내지 않았고, 22.4mM 포도당 함유 배지에서 배양한 세포의 SOD는 효소 활성도가 변화되어 췌장 베타세포 항산화 효소 중 SOD가 고농도 포도당에 의하여 가장 민감하게 반응하는 것으로 나타났다. 또한 MIN6N8a세포를 배양한 후 paraquat을 첨가하여 생존한 세포를 MTT 법으로 측정한 결과 22.4mM 포도당 농도에서 배양한 세포가 5.6mM 포도당 농도에서 배양한 세포에 비하여 paraquat 농도 100, 200 및 400μM에서 MTT 환원비율이 현저히 저하되었다. 고농도 포도당이 MIN6N8a세포의 유리기생성량에 미치는 영향을 형광량을 confocal microscope으로 측정한 결과 22.4 mM 포도당에서 1시간 배양한 세포에서 5.5mM 포도당 농도에서 배양한 세포에 비하여 2.9배 증가되었다. 결론: 유리기의 생성량 증가나 소거량 감소는 세포의 산화스트레스를 증가시키는데, 생쥐 인슐린종 세포인 MIN6N8a세포에서 고농도 포도당에 의해서 유리기 생성량이 증가되고, CuZn-SOD 활성도가 감소되는 것은 세포의 산화스트레스를 증가시켜서 세포손상을 유발 할 수 있으므로, 고농도 포도당은 췌장 베타세포의 손상 유발에 의한 당뇨병 발병의 한 요인으로 작용 할 수 있을 것으로 생각된다. Background: To investigate the effects of high glucose on oxidative stress of islet beta cells, the effects of high glucose on antioxidant enzymes, the production of free reactive substances and paraquat-induced cytotoxicity were examined in cultured mouse insulinoma cells(MIN6N8a). Methods: The MIN6N8a cell line(Obtained from Diabetic research center, University of Calgary, Canada) was maintained in RPMI1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, at 37℃ under an atmosphere of 5% CO2 and 100 % humidity. The MIN6N8a cells were cultured in high glucose(22.4 mM) and normogl-ucose(5.6 mM) containing RPMI1640 media, for 1-6 days, and the superoxide dismutase(SOD), catalase and glutathione peroxidase(GSHPx) activities in the MIN6N8a cells assayed. The levels of reactive oxygen species in the MIN6N8a cells was determined using dihydroethidium(DHE). Paraquatinduced cytotoxicity was determined using the 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5diphenyl tetraz olium bromide(MTT) method. Results: No difference was observed catalase in the catalase and GSHPx activities in MIN6N8a cells between the high glucose(22.4mM) and normoglucose(5.6mM) groups. The CuZn-SOD activity of MIN6N8a cells was decreased by 32% in the high glucose(25.4 mM) medium compared to normoglucose(5.6 mM) medium, while the Mn-SOD act