Pseudomonas putida 由来DpkA の耐熱化とN-メチル-L-フェニルアラニン合成への応用

DpkAはN -メチル-L-アミノ酸デヒドロゲナーゼと1-ピペリデイン-2-カルボン酸／1-ピロリン-2-カルボン酸レダクターゼ活性を持つ．DpkAは医薬品のキラルビルディングブロックとして役立つN -メチル-L-アミノ酸やL-ピペコリン酸の生産に有用である．DpkAを用いてこれらの化合物の工業的合成法を構築するために，エラープローンPCRによるDpkAの耐熱化を行った．V117MとQ302Rの変異は本酵素の耐熱性を改善した．野生型DpkAは30℃まで安定で，50℃で失活するが，V117M/Q302R変異DpkAは45℃まで安定で，55℃で失活した．V117MとQ302Rの変異はDpkAのキネティック・パラメータに僅かな影響を及ぼしたが， N -メチル-L-フェニルアラニンの酵素合成に変異DpkAを利用することができた．DpkAは補酵素としてNADPHを必要とするため，Bacillus subtilis 由来グルコースデヒドロゲナーゼを耐熱化し，N -メチル-L-フェニルアラニン合成のためのNADPH再生用酵素として用いた．24時間の反応後，野生型酵素は16.4 mMのN -メチル-L-フェニルアラニンを生産したが，耐熱化酵素では0.13 MのN-メチル-L-フェニルアラニンが生産された．