배양된 소 각막내피세포에서 Endothelin 수용기 매개에 의한 세포내 유리 칼슘의 변화

배양된 소의 각막내피세포에서 peptidyl hormone인 endothelin 이 각막내피세포의 세포내 신호전달계에 미치는 영향을 알아보고 세포막에 Endothelin(ET) 수용기의 존재 여부 및 그 종류를 알아보고자 본 연구를 시도하였다. 적출한 소의 안구에서 각막 내피세포를 분리한 다음 2-4회 계대배양하여 사용하였다. Endothelin 처치후의 세포내 칼슘측정은 35mm 배양접시바닥에 만든 1.07cm 크기의 원형 배양공간에 배양접시당 104개의 세포를 분주한 다음 InCaTM Imaging System(Intracellular Imaging Inc, cincinnati, OH, USA)를 이용하여 세포의 형광량을 실온에서 측정하였다. 또한 ET 투여후 세포내 Inositol trisphosphate의 축적양을 측정하였으며 세포막에 존재하는 endothelin 수용기의 유무와 종류를 알아보기 위하여 ET수용기 길항제인 BQ-610과 BQ-788 처치후 세포내 칼슘 농도변화를 측정하였다. Endothelin 투여후 세포내 칼슘농도의 증가는 농도에 의존성을 보이는 상관관계를 나타내었다. ET-1 에 의한 세포내 캄슘증가의 원인은 세폰 및 세포외 캄슘의 이동에 의한 것임을 알 수 있었다. 또한 세포내 inositol trisphsphate의 수축을 유발하는 것으로 보아 이러한 반응은 phospholipase C 작용을 통해 이루어진다고 생각된다. ET 수용기 탈감작과 선택적인 ETA 및 EtB 수용기 길항제 투여에 의한 실험에서 소의 각막내피세포에 ETB수용기가 존재하며 endothelin에 의한 세포내 칼슘의 변화는 ET 수용기 매게의 의한 작용임을 알 수 있었다(한안지 40:31~39, 1999). To investigate the effect of endothelin on intracellular free calcium ([Ca2+]i) mobilization and the existence of the endothelin receptor in cultured bovine corneal endothelial cells(BCEC), endothelin-1(ET-1) -induced [Ca2+]i increase was measuredby using calcium sensitive indicator, fura-2/AM, and the studies on its desensitizaton and receptor antagonists were also performed. ET-1 increased [Ca2+]i in a concentration-dependent manner(10-9M-10-5M) and ET-1 -unduced [Ca2+]i transient increase was significantly ingibited(~50%) by the pretreatment with EGTA for 1 min. Similarly, neomycin also attenuated ET-1 -unduced [Ca2+]i transient increase in a concentration-dependent mannet. Desensitizatin study with successive treatment of ET-1 and ET-3, and the experiments of antagonists(BQ-610 for the ETA receptor and BQ-788 for the ETB receptor) showed the presence of ETB receptor in BCEC. In addition, ET-1(10-6M) accumulated inositol trisphosphate about two folds (310±6.8 cpm) comparing to control(154±11.6 cpm) and this accumulation was significantly inhibited by the treatment with neomycin (187±28 cpm). These results suggest that endothelin-induced calcium mobilization is receptor-mediated response and TEB receptor exists in BCEC(J Korean Ophthalmol Soc 40:31~39, 1999).