Bedeutung von Rad51 für Reparatur Replikationsassoziierter DNA-Schäden in humanen Tumorzellen

Die Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität ist das fundamentale Ziel der Zelle. Dabei ist eine fehlerfreie DNA-Replikation in jedem Zellzyklus von größter Bedeutung. Trifft ein Replikationsapparat auf einen DNA-Doppelstrangbruch, bewirkt dies, dass die Homologe Rekombination mit seinem zentralen Protein Rad51 als der Hauptreparaturmechansimus aktiv wird. Der DNA-Schaden wird dabei von sogenannten Sensorproteinen erkannt, die wiederum Zellzykluskontrollproteine aktivieren und zu einem Anhalten der S-Phase führen. Weitere Initiationsereignisse der Replikation werden unterdrückt, Reparaturprozesse in Gang gesetzt und der Schaden behoben. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, wie sich ionisierende Strahlen und die durch Bestrahlung erzeugten DNA-Schäden auf den Replikationsapparat, die Aktivierung des Intra-S-Phase-Kontrollproteins Chk1 und ihren Folgen für die genomische Instabilität auswirken. Es sollte der spezifische Effekt von Basenschäden, Einzelstrangbrüchen, DNA-DNA-Quervernetzungen, sowie zweiseitigen und einseitigen Doppelstrangbrüchen untersucht werden, um dies dann mit dem Schadensspektrum der ionisierenden Strahlen zu vergleichen. Von besonderem Interesse war es zu überprüfen, ob eine Hochregulation von Rad51, zu einer veränderten Antwort der Replikationsprozesse und der genomischen Stabilität nach DNA-Schädigung führt. Die Experimente wurden mit U2OS-Zellen durchgeführt, in denen durch Transfektion des Rad51-Gens eine transiente Überexpression von Rad51 durch einen hormoninduzierbaren Promoter erzielt werden konnte (Maacke et al., 2000). Als Kontrolle dienten U2OS-Zellen, bei denen keine Hormoninduktion durchgeführt wurde. Die Auswirkungen der verschiedenen DNA-Schäden wurden im DNA Fibre Assay, im Western-Blot, an γH2AX-FOCI und Chromosomaberrationen sowie im Koloniebildungsassay untersucht. Für Zellen mit normaler Rad51 Expression zeigte es sich, dass DNA-Doppelstrangbrüche die toxischsten Schäden während der Replikation waren. Sowohl zweiseitige, als auch einseitige DSB führten zur starken Inhibition der Elongation, zum Anhalten von Replikationsgabeln und zu einer schnellen und langen Aktivierung des Intra-S-Phase Kontrollproteins Chk1. Dies ging einher mit der Inhibition weiterer Initiationsereignisse. Eine ionisierende Bestrahlung wirkte sich nur auf den Elongationsprozess, nicht aber auf das Anhalten von Replikationsgabeln aus. Sie bewirkte außerdem nur eine schwache und späte Aktivierung von Chk1, sowie eine geringere Inhibition