Characterization of adipose triglyceride lipase

Unter Säugetieren wird Energie hauptsächlich in Form von Triacylglycerol (TAG) gespeichert welche im Fettgewebe als Lipid-tropfen (Lipid droplets) vorliegen. Bei Energiebedarf werden diese unter Freisetzung von nicht esterifizierten freien Fettsäuren (NEFA) hydrolysiert um Energiegewinn via ?-oxidation zu gewährleisten. Lipolyse, der Abbau von TAG, stellt einen hochregulierten Prozess dar, welcher von drei Enzymen katalysiert wird. Adipöse Triglycerid Lipase (ATGL) katalysiert den ersten, geschwindigkeitsbestimmenden Schritt welcher zur Freisetzung der ersten NEFA führt. Hormonsensitive Lipase (HSL) und Monoacylglycerol Lipase (MGL) hydrolysieren die Esterbindung der zweiten sowie dritten Fettsäure zum Glycerol Grundgerüst. Das minimale Konstrukt von ATGL welches seine enzymatische Aktivität behält ist 254 Aminosäuren lang und wurde determiniert von Irina Cornaciu, einem Mitglied unserer Gruppe (Manuskript in Präparation). Das Ziel dieser Arbeit beinhaltete die Entwicklung eines Protokolls zur Reinigung des minimalen Konstrukts von ATGL um damit kristallographische bzw. biophysikalische Experimente durchführen zu können. Maus ATGL 254 (mATGL254) wurde in verschiedene Vektoren kloniert und die Expression in E.coli optimiert. In den Reinigungsexperimenten wurde versucht Hürden wie das Auftreten von ?Inclusion bodies? und löslichen Proteinaggregaten zu meisten. Vielversprechende Ergebnisse lieferte mATGL254 gekoppelt an Maltose-binde-Protein, wobei sehr hohe Ausbeuten erzielt wurden. Die Bildung von löslichen Aggregaten konnte jedoch trotz intensiver Bemühungen nicht verhindert werden. Smt-mATGL254 stellt ein Konstrukt dar welches zwar in geringen Mengen aber dafür in monomerer Form gewonnen werden konnte. Der Vektor wurde dahingehend verändert eine TEV-Protease Schnittstelle sowie einen (His)8- tag an Stelle eines (His)6- tags zu tragen da sich herausgestellt hatte das eine Reinigung des Fusionsproteins nur unter denaturierenden Bedingungen zu hohen Ausbeuten führt. In mammals the main energy storage is represented by triacylglcerol (TAG) accumulated in lipid droplets (LD) in adipose tissue. In times of energy demand TAGs are hydrolyzed with subsequent release of non-esterified fatty acids (NEFAs) to produce energy via ?-oxidation. Lipolysis, the breakdown of TAG is a highly regulated process catalyzed by three enzymes. Adipose triglyceride lipase (ATGL) is in charge of the first and rate limiting step, as it catalyzes the release of the first NEFA from the