Establishment of a mass spectrometry-based high-throughput sample work-up protocol and intracellular metabolite profiling of Glioblastoma multiforme cells

Metabolite sind als biologische Zwischenprodukte biochemischer Reaktionen essentiell für die lebende Zelle, da sie aktive Stoffwechselwege verbinden. Metabolit- Levels geben einen einzigartigen chemischen Fingerabdruck des physiologischen Zustands der Zelle und erlaubt die Definition des zellulären Phänotyps durch das Messen der Metabolit- Profile. Adhärente Zellen sind weit verbreitet in klinischen Bereichen, wodurch diese Zellsysteme relevante Ziele für Metabolomics-Studien darstellen. Die hohe Analytzahl erfordert ein maßgeschneidertes Quenching- und Extraktionsprotokoll, sowie eine hochentwickelte Detektions- und Datenauswertungsmethode. Vor allem klinische Anwendungen benötigen High-Throughput Methoden. Da bekannte Probenaufarbeitungsprotokolle und Datenauswertungsmethoden nicht ausreichten, musste ein geeignetes Protokoll entwickelt werden. Um den Krebszellstoffwechsel zu untersuchen, wurde eine Bibliothek mit Informationen über LC-MS spezifischen Daten von 207 Metaboliten erstellt. Ein neuartiges Probenaufarbeitungsprotokoll, basierend auf „Boiling Ethanol“, wurde für adhärent wachsende Säugetierzellen entwickelt, wobei der Glioblastoma multiforme Stamm U-87 MG (GBM) als Repräsentant gewählt wurde. Gegenüber der derzeit etabliertesten Methode zeigte dieses Protokoll höhere Metabolitausbeuten und erlaubte eine 7-fach schnellere Probenprozessierung. Die Ausbeute konnte durch ein zusätzliches „Post Treatment“ weiter erhöht werden. Umfassende Temperatur- Profiling- Studien zeigten, dass der „Workflow“ signifikant die Probentemperatur beeinflusste. Weiters wurde ein Software- Tool identifiziert, das eine bis zu 40 Stunden schnellere Datenanalyse ermöglicht. Die Tauglichkeit des neuen Aufarbeitungsprotokolls wurde in dieser Arbeit demonstriert und angewandt. Metabolit- Profiling von GBM Zellen, kultiviert unter zwei physiologischen Zuständen, führte zu Zielen von potentieller klinischer Relevanz und repräsentieren ein Fundament für nachfolgende Studien. As a result of their role as biological intermediates of biochemical reactions, metabolites play an important part for the living cell connecting the many different active pathways. The metabolite levels give a unique chemical fingerprint for a physiological cellular state, making it possible to define the cell phenotype by measuring the metabolite profile. Adherently growing cells are widely used in clinical applications, making these cell systems relevant targets for metabolomics studies. Due to the larg