SPERMATOZOA VE EMBRIYOLARIN GEN EKSPRESYON ANALIZI ONCESINDE RNA IZOLASYONU VE HUCRESEL RNA MIKTARLARININ BELIRLENMESI/RNA ISOLATION AND DETECTION OF CELLULAR RNA QUANTITY OF SPERMATOZOA AND EMBRYOS PRIOR TO GENE EXPRESSION ANALYSES

Amaç: Üreme biyolojisi arastirmalarinda kullanilan örnekler genellikle, zor ulasilabilir, nadir ve tekrari olmayan hücre gruplaridir. Diger yandan, az sayida hücre ile çalisildigindan dolayi, genetik analizlerde standart olarak kullanilan yöntemlerde modifikasyonlara ihtiyaç duyulmaktadir. Bu çalismada amacimiz, gen ekspresyonu arastirmalarinda kullanilabilecek optimal düzeydeki total RNA'nin elde edilebilmesi amaci ile spermatozoa ve embriyo örneklerinden RNA izolasyon yönteminin gelistirilmesidir. Gereç ve Yöntem: Yardimla üreme tedavisi kapsaminda kullanilmak amaci ile hazirlanan ve fertilizasyon islemi gerçeklestirildikten sonra geriye kalan spermatozoa örnegi diger kontaminant hücrelerden saflastirilarak dondurulmustur. Diger yandan, embriyo transferinden sonra geriye kalan preimplantasyon dönem embriyolar fosfat tamponlu tuz--polivinil alkol (PBS-PVA) karisimi içerisinde dondurularak saklanmistir. Spermatozoa ve embriyolardan optimal düzeyde total RNA elde edilmesi amaci ile çesitli optimizasyonlar yapilmistir. Elde edilen total RNA'lar kaliteleri ve miktarlari açisindan degerlendirilmistir. Spermatozoonda 28S ribozomal RNA (rRNA)'nin seçimli olarak degrade olmasindan dolayi total RNA kalitesi, Bioanalyzer cihazi ile gerçeklestirilen analize ek olarak gerçek zamanli kantitatif PCR ile gen amplifikasyonu yapilarak da kontrol edilmistir. Bulgular: Izolasyonda yapilan uyarlamalardan sonra, takip eden gen ekspresyonu çalismalarinda kullanilabilecek kalitede ve miktarda total RNA elde edilmistir. Ek olarak, örneklerden elde edilen hücresel total RNA miktarlarinin önceki çalismalar ile uyumlu oldugu belirlenmistir. Sonuç: Daha sonra yapilmasi planlanan transkript profilleme arastirmalari için ön bir çalisma olarak gerçeklestirilen bu deneylerin sonucunda elde edilen bulgular, RNA izolasyon protokollerinde yapilan uyarlamalarin etkin oldugunu göstermektedir. Anahtar Kelimeler: Spermatozoon, preimplantasyon dönem embriyo, RNA Objective: Biological samples that are analyzed in reproductive biology are generally rare, difficult to obtain, and a nonreplicable group of cells. Furthermore, investigating low numbers of cells requires modifications to the routine methods used in genetic analyses. The aim of our study was to improve RNA isolation methods for obtaining a sufficient amount of total RNA from spermatozoa and embryo samples for downstream gene expression analyses. Materials and Methods: Excess spermatozoa samples (that had been prepared in the scope of a