KINASE RECEPTOR ACTIVATION ASSAY

An assay for measuring activation (i.e., autophosphorylation) of a tyrosine kinase receptor of interest is disclosed. a) A first solid phase is coated with a substantially homogeneous population of cells so that the cells adhere to the first solid phase. The cells have either an endogenous tyrosine kinase receptor or have been transformed with DNA encoding a receptor or "receptor construct" and the DNA has been expressed so that the receptor or receptor construct is presented in the cell membranes of the cells. b) A ligand is then added to the solid phase having the adhering cells, such that the tyrosine kinase receptor is exposed to the ligand. c) Following exposure to the ligand, the adherent cells are solubilized, thereby releasing cell lysate. d) A second solid phase is coated with a capture agent which binds specifically to the tyrosine kinase receptor, or, in the case of a receptor construc, to the flag polypeptide. e) The cell lysate obtained in step c) is added to the wells containing the adhering capture agent so as to capture the receptor or receptor construct to the wells. f) A washing step is then carried out, so as to remove unbound cell lysate, leaving the captured receptor or receptor construct. g) The captured receptor or receptor construct is exposed to a labelled anti-phosphotyrosine antibody which identifies phosphorylated residues in the tyrosine kinase receptor. h) Binding of the anti-phosphotyrosine antibody to the captured receptor or receptor construct is measured. L'invention se rapporte à une méthode de mesure de l'activation (c'est-à-dire l'autophosphorylation) d'un récepteur de tyrosine kinase d'intérêt. a) Une première phase solide est recouverte d'une population de cellules pratiquement homogène de sorte que ces dernières adhèrent à la première phase solide. Les cellules ont soit un récepteur de tyrosine kinase endogène, soit ont été transformées par l'ADN codant un récepteur ou "un produit de recombinaison du récepteur", et l'ADN a été exprimé de sorte que le récepteur ou le produit de recombinaison du récepteur soit présent dans les membranes des cellules. b) Un ligand est alors ajouté à la phase solide comportant les cellules d'adhésion de sorte que le récepteur de tyrosine kinase soit mis en contact avec le ligand. c) Après la mise en contact du récepteur avec le ligand, les cellules d'adhésion sont solubilisées, libérant ainsi le lysat cellulaire. d) Une seconde phase solide est recouverte d'un agent de capture qui se fix