CONDITIONALLY RESPONSIVE CRISPRA USING PROTEIN-PROTEIN INTERACTION

High-performance promoters, and other high-performance components, for the construction of CRISPR-based synthetic gene regulatory networks (GRNs) and methods for engineering and using the promoters and components. Activatable promoters with lower basal and higher activated expression levels can be engineered with sequence-based design and in vivo high-throughput screening. The promoters achieve up to a 1000-fold dynamic range in an E. coli-based cell-free system (CFS) and constitute a 33-fold improvement in CRISPRa efficiency and enable implementation of large circuits not accessible with previous components, including six-layer deep and four-branch parallel cascades. The disclosed components enable assembly of novel input signal processing modules, including blue light responsive CRISPRa/i circuits and conditional CRISPRa based on small-molecule responsive protein-protein interactions. Multi-input processing networks can integrate the disclosed modules into a dynamic, two-input CRISPRa/i pulse generator. L'invention concerne des promoteurs à haute performance et d'autres composants à haute performance, pour la construction de réseaux de régulation génique (RRG) synthétiques basés sur CRISPR, ainsi que des procédés d'ingénierie et d'utilisation des promoteurs et des composants. Des promoteurs activables avec des niveaux d'expression basaux inférieurs et activés supérieurs peuvent être modifiés avec une conception basée sur une séquence et un criblage à haut débit in vivo. Les promoteurs atteignent une plage dynamique jusqu'à 1000 fois supérieure dans un système acellulaire (CFS) à base de E. coli et représentent une amélioration d'un facteur de 33 de l'efficacité de CRISPRa, et permettent la mise en œuvre de grands circuits non accessibles avec des composants existants, y compris des cascades parallèles à quatre branches et à six couches de profondeur. Les composants divulgués permettent l'assemblage de nouveaux modules de traitement de signal d'entrée, comprenant des circuits CRISPRa/i sensibles à la lumière bleue et un CRISPRa conditionnel basé sur des interactions protéine-protéine sensibles aux petites molécules. Des réseaux de traitement à entrées multiples peuvent intégrer les modules divulgués dans un générateur d'impulsions CRISPRa/i dynamique à deux entrées.